RRx‑001介导Nrf2减弱DOX诱导的心肌细胞损伤

周玉玲，曹德康，李震宇，苏建忠，王欣，潘欢

（1.中国人民武装警察部队特色医学中心突发公共卫生事件医学防治研究所，北京 102613；2.嘉兴市第一医院，浙江嘉兴 314000）

阿霉素（doxorubicin，DOX）和柔红霉素（dauno‑rubicin，DNR）属于蒽环类抗生素，在临床上广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗，包括白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和卵巢癌[1]。然而由于阿霉素高累积剂量（>450~550 mg/m2）所引起的心肌毒性，这大大限制了其临床应用[2]。这种阿霉素治疗而导致的医源性并发症（心脏损伤）将给患者的生活质量带来极大的影响，同时，由于多数肿瘤患者运动的缺乏反而可能加速心脏衰竭的发生[3]。

RRx‑001是一种无毒、抗肿瘤耐药的抗肿瘤药物[4]，目前已进入Ⅲ期临床实验[5]。RRx‑001不仅能增加肿瘤放疗和化疗的敏感性[6‑8]，且对正常组织具有放射保护作用[9]，这可能和RRx‑001选择性的调控活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的释放，特别是一氧化氮（NO）的释放有关[10‑11]。与正常细胞相比，肿瘤细胞能够产生更多的ROS，这就迫使机体更加依赖抗氧化物质以维持正常生存，例如还原型谷胱甘肽（GSH）[12]，因此，当机体抗氧化系统损伤时细胞更易受到损伤。相比之下，由于正常细胞的基础ROS水平较低且抗氧化能力高，正常细胞能够承受更高水平的氧化应激。缺血再灌注造成的ROS大量释放是心肌细胞缺血再灌注损伤的主要原因。已有文献报道，仓鼠心脏缺血再灌注前使用RRx‑001预处理可提高心肌细胞活力，减少心肌细胞凋亡[13]。核因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞调节抗氧化反应的一种重要转录因子，通过抗氧化反应元件（ARE）调控抗化基因的表达，增加细胞对氧化应激的抗性[14]。有研究报道，缺乏Nrf2可加重阿霉素所致心肌毒性和损伤[15]，但在心肌细胞中RRx‑001是否影响Nrf2表达尚未报道。

由于约有10%的患者接受了阿霉素或其衍生物的治疗，将有可能发展为心脏并发症[16]，且现有的心脏保护措施不足，迫切需要寻找替代治疗策略。Oronsky等[17]最近的研究表明，使用RRx‑001预处理可改善阿霉素急性处理诱导的小鼠心肌功能损伤，但具体机制尚不清楚。本文将从细胞水平上探讨RRx‑001对于阿霉素诱导的心肌细胞毒性是否具有心肌保护作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

H9c2细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司。阿霉素（doxorubicin，DOX）和RRx‑001购自大连美仑生物技术有限公司；ML385购自MedChem‑Express公司；Nrf2和GAPDH抗体购自Abcam公司；荧光二抗购自Li‑cor公司；MTT试剂盒、Dihy‑droethidium超氧化物阴离子荧光探针试剂盒、总SOD活性检测试剂盒（NBT法）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH‑Px）检测试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒和青链霉素混合液购自碧云天生物技术公司；SDS‑PAGE凝胶试剂盒购自上海雅酶生物科技有限公司；DMSO溶液购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自HyClone公司。酶标仪（ELX800，德国BIOTEK公司）；凝胶电泳仪（1658001/1645050/1703935，美国Bio‑Rad公司）；超净工作台（B3，苏州净化工程设备有限公司）；细胞培养箱（3311，美国Thermo Fisher公司）；化学发光成像系统（GeneGnome XRQ，英国Syngene公司）；细胞破碎仪（Q125，德国Q SONIC公司）；涡旋振荡器（88880018，美国Thermo Fisher公司）；离心机（Allegra x‑12R，美国贝克曼公司）；荧光显微镜（DP80/BX43，美国奥林巴斯公司）。

1.2 MTT检测细胞活力

将H9c2细胞消化转移至96孔板中，细胞计数，稀释至每孔约5×103个细胞。待细胞稳定贴壁后，给予相应药物处理，继续培养12 h后，弃去上层培养基，并加入100μL纯DMEM培养基配置的MTT溶液（500μg/mL）。置于细胞培养箱中静置4 h。弃去上层MTT溶液，加入150μL DMSO，并混合均匀。使用酶标仪于490 nm处测定吸光度A值，以对照组标准化，检测细胞活力变化。

1.3 Western blot检测Nrf2蛋白表达水平

细胞处理完毕后，加入50~100μL细胞裂解液（RIPA∶磷酸酶抑制剂:蛋白酶抑制剂=100∶10∶1），置于冰上裂解15 min，使用细胞刮刀刮下细胞，并转移至1.5 mLEP管中。使用细胞破碎仪30%频率破碎细胞5次，每次3 s。之后使用涡旋仪涡旋振荡3次。4℃离心机13 500 r/min离心15 min。将上层透明液体转移至新的1.5 mLEP管中，并使用BCA试剂盒用酶标仪在562 nm处测定吸光度值，计算蛋白浓度。之后加入1/5体积的6×Loading Buffer缓冲液，100℃煮5 min后用于后续实验。使用配胶试剂盒配置适宜浓度的SDS‑PAGE凝胶，在每个加样孔中加入适宜体积的蛋白混合样品，在100 V恒压下进行凝胶电泳，待蓝色印迹到达凝胶底侧时停止电泳。取出凝胶，300 mA恒流转膜1 h。取出NC膜，放置于PBS缓冲液配制的5%脱脂奶粉溶液，封闭1 h。封闭完毕后，使用3%BSA配制一抗（1:1 000），于4℃冰箱中过夜。过夜后，PBST溶液洗涤，使用5%脱脂牛奶配制二抗孵育液（1:10 000），置于摇床上室温孵育1 h，此过程中注意避光。二抗孵育完毕后，在避光条件下使用PBST溶液洗涤4次。使用ECL化学发光法扫描蛋白条带，并统计蛋白条带灰度值，以对照组做标准化。

1.4 ROS的检测

使用Dihydroethidium超氧化物阴离子荧光探针检测细胞中ROS的变化。将处理后的细胞消化备用。使用无血清培养液稀释dihydroethidium（1∶1 000），终浓度为10μmol/L。将收集好的细胞悬浮于稀释好的dihydroethidium，细胞密度为1.0×106~2.0×107。37℃细胞培养箱内孵育15 min。用荧光显微镜于535 nm激发波长处观察荧光强度并拍照，并使用Image Pro Plus软件统计荧光强度。

1.5 SOD、GSH‑Px和MDA的检测

细胞中SOD、GSH‑Px和MDA水平分别使用总SOD活性检测试剂盒（NBT法）、GSH‑Px检测试剂盒、MDA检测试剂盒检测，根据试剂盒说明书进行操作检测。

1.6 数据统计

实验结果以±s表示，使用GraphPad Prism 7软件进行统计及图表绘制。两组间的比较使用t配对/非配对检验，多组间的使用方差分析（one‑way ANOVA followed by Newman‑Keules）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RRx‑001对阿霉素诱导心肌细胞毒性的影响

培养H9c2大鼠心肌细胞，给予0、0.05、0.1、0.5、1、5μmol的阿霉素12 h诱导心肌细胞损伤，图1结果显示阿霉素剂量依赖性地抑制细胞活力，诱导心肌细胞损伤。而使用1μmol/L的RRx‑001预处理H9c2细胞1 h后再加入阿霉素处理细胞，相比于阿霉素单独处理，RRx‑001可减弱阿霉素（0.1、0.5、1、5μmol）诱导的心肌细胞毒性，说明RRx‑001对于阿霉素诱导的心肌细胞毒性具有心肌保护作用。

图1 RRx‑001减弱阿霉素诱导的心肌细胞毒性Figure 1 RRX‑001 attenuates DOX‑induced cardiac cytotox‑icity(n=6)

2.2 RRx‑001对Nrf2表达的影响

图2 A中Western blot检测结果显示，阿霉素（5μmol/L）处理H9c2细胞12 h后显著降低细胞中Nrf2的蛋白表达，而使用RRx‑001（1μmol/L）预处理1 h后，阿霉素（5μmol/L）诱导的Nrf2蛋白表达下降被显著逆转，且该逆转作用可被Nrf2特异性抑制剂ML385（1μmol/L）抑制。同时图2B中MTT结果显示RRx‑001（1μmol/L）可显著逆转阿霉素（5μmol/L）所诱导的心肌细胞损伤，但与RRx‑001同时给予Nrf2特异性抑制剂ML385（1μmol/L）时，RRx‑001（1μmol/L）的心肌保护作用被取消，说明RRx‑001通过激活Nrf2发挥心肌保护作用，减弱阿霉素诱导的心肌细胞毒性作用。

图2 RRx‑001对Nrf2的表达影响Figure 2 Effect of RRx‑001 on the expression of NRF2(n=6)

2.3 RRx‑001对阿霉素诱导的ROS、SOD、GSH‑px及MDA变化的影响

图3 结果显示，阿霉素（5μmol/L）可显著增加H9c2细胞中ROS的生成，而使用RRx‑001（1μmol）预处理后，和阿霉素单独处理相比，阿霉素诱导的ROS的增多被显著抑制。同时，阿霉素（5μmol/L）处理H9c2细胞12 h后，细胞内抗氧化因子SOD、GSH‑px水平下调，MDA水平上调，给予RRx‑001（1μmol/L）预处理1 h后，和阿霉素（5μmol/L）组相比，H9c2细胞内SOD、GSH‑px水平显著上调，MDA水平被抑制（表1）。基于上述结果，RRx‑001可通过上调Nrf2表达，增强H9c2细胞的抗氧化能力，上调细胞内SOD和GSH‑Px水平，抑制细胞内MDA水平，控制ROS的过量生成，进而减弱阿霉素诱导的心肌细胞损伤。

表1 RRx‑001对阿霉素诱导的氧化应激因子表达变化的影响Table 1 Effect of RRX‑001 on the expression of oxidative stress factors induced by DOX(n=6)

3 讨论

肿瘤依然是世界上威胁人类健康的主要疾病，而阿霉素作为一种多肿瘤抗癌药物，由于其副作用导致其临床应用大大受限。右雷佐生作为临床上用于减轻或减少蒽环类抗生素（如阿霉素）化疗引起的心肌毒性的一种抗肿瘤辅助药品，由于其可能削弱阿霉素的抗肿瘤活性也被限制了应用[18]。文献报道，肾素‑血管紧张素系统的紊乱可能是蒽环类抗生素引起心脏毒性的原因，但血管紧张素受体抑制剂和血管紧张素转换酶抑制剂已知的抗氧化特性，在理论上也可以抵消对肿瘤细胞的化学治疗作用[19]。相比之下，RRx‑001作为一个抑制肿瘤耐药，且已经进入Ⅲ期临床实验的抗肿瘤药物，不仅对正常细胞或组织具有保护作用，还可选择性地杀死肿瘤细胞，具有巨大的临床价值。本研究结果表明，RRx‑001可以减弱阿霉素诱导的心肌细胞毒性，其中Nrf2参与了RRx‑001的心肌保护作用，RRx‑001可逆转阿霉素诱导的Nrf2表达下调，促进SOD和GSH‑Px抗氧化因子的生成，抑制MDA的水平，调控ROS的过量生成。同时还可以看出，将RRx‑001运用到癌症患者的新辅助治疗时具有2个优势，RRx‑001不仅可以减轻阿霉素治疗引起的心脏毒性，还能加强阿霉素对于肿瘤的杀伤作用。

Nrf2作为一类重要的抗氧化转录因子，能够调节下游抗氧化蛋白的表达以抵抗氧化应激损伤。在正常条件下，Nrf2与Keap1结合，存在于细胞之中，发生氧化应激时，Keap1的半胱氨酸残基被修饰，改变构象导致Nrf2释放出来，进入细胞核中，与ARE结合后，促进下游抗氧化酶的基因转录，例如醌氧化还原酶1、血红素加氧酶1和谷胱甘肽S‑转移酶等。本研究结果显示，阿霉素处理后的H9c2细胞中Nrf2的表达下降，RRx‑001可逆转阿霉素诱导的Nrf2表达下降；同时阿霉素可引起H9c2细胞氧化应激增多，ROS过量生成，表现为SOD、GSH‑Px活性降低，MDA水平增高，而给予RRx‑001预处理后，抗氧化能力增强，ROS水平被抑制，说明RRx‑001通过激活Nrf2，降低了阿霉素诱导的H9c2心肌细胞损伤和氧化应激的作用。

综上所述，RRx‑001可通过增加H9c2细胞中Nrf2表达，增强细胞抗氧化能力，减弱阿霉素诱导的心肌细胞损伤，这对于研究阿霉素心肌细胞损伤的治疗及作用机制具有重要意义。