NOX4抑制剂GKT137831诱导肺鳞癌H226细胞凋亡及增强紫杉醇敏感性的研究

宋少飞，刘冰

（广东药科大学药学院，广东广州 510006）

癌症是目前影响人类生命健康的重要疾病。近年来死于癌症的人数逐年增加，其中肺癌作为最常见的癌症之一，其发病率和致死率在众多癌症中位居榜首。肺癌主要有两种类型，小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和非小细胞肺癌（non‑small cell lung carcinoma，NSCLC），其 中NSCLC约占肺癌总数的80%~85%，而NSCLC又包括肺鳞癌、肺腺癌、大细胞癌。与肺腺癌不同的是，肺鳞癌的发病与吸烟密切相关，多为中央型，容易累及大血管，出现中心空泡和大出血，危及生命。且现有化疗效果较差，治疗方案有限，预后不良[1]。因此迫切需要探索新的、更加有效的抗肺鳞癌药物以及治疗方案。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotnamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)是一种广泛分布于机体内各个组织的跨膜蛋白，包括NOX1，NOX2，NOX3，NOX4，NOX5，以及Duox1和Duox2等7个亚型[2]。其中NOX4与癌症的发生发展密切相关，抑制NOX4活性能够抑制肿瘤的生长并促进癌细胞的死亡[3]。此外，有研究发现，在肺腺癌及肺鳞癌中，NOX4在癌组织中的表达量显著高于癌周组织[4]。除此之外，目前已证实在A549细胞中，NOX4过表达能提高白细胞介素‑6（interleukin‑6，IL‑6）的自分泌水平。IL‑6是促进NSCLC恶性进展最重要的炎症因子之一，可由多种炎性细胞产生并分泌，肿瘤细胞自身也可产生大量IL‑6[5‑6]。体内外实验表明，IL‑6促进NSCLC细胞增殖的原因，可能与肿瘤细胞中激活Jak2/Stat3信号通路有关[7‑9]。上述提示NOX4可能是抗NSCLC的一个潜在有效靶点。

GKT137831是NADPH氧化酶NOX4和NOX1亚型的双重抑制剂。其在体外和体内动物药理模型中显示出生物学活性，包括治疗肝纤维化、动脉粥样硬化等[10‑11]。在肺腺癌A549细胞中，GKT137831能够增强顺铂对细胞的毒性效应[12]。因此，GKT137831对于肺鳞癌的治疗值得进一步探讨。

本研究以肺鳞癌H226细胞为实验对象，检测GKT137831和紫杉醇单用以及二者联用对细胞生存的影响，检测GKT137831对肺鳞癌H226细胞凋亡的影响，检测GKT137831对肺鳞癌H226细胞中IL‑6 mRNA表达的影响，并初步探讨GKT137831是否通过IL‑6/Jak2/Stat3信号通路诱导肺鳞癌H226细胞凋亡，有望为GKT137831的临床抗肺鳞癌应用提供实验依据。

1 材料

1.1 药物与试剂

GKT137831、紫杉醇均购于美国Selleck公司。细胞培养试剂购于美国Gibco公司。Annexin V‑FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于贝博生物科技公司。BCA蛋白定量试剂盒购于Thermo Scientific公司。SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液购于Mikx公司。p‑Jak2、Jak2、p‑Stat3、Stat3、Bcl‑2、Bax及β‑Tubulin抗体购于美国Abcam公司。山羊抗兔IgG购于Cell Signaling Technology公司。RNA快速提取试剂盒（RN001）购于上海奕杉生物科技公司。Rever Tra Ace recerse transcriotase和SYBR Green Realtime PCR Master Mix均购于TOYOBO。

1.2 主要仪器

HF151UV型CO2培养箱购于上海力申科学仪器有限公司。A35062CN流式细胞仪、1510酶标仪购于Thermo Scientific公司。Microfugu20R冷冻离心机购于Beckman coulter公司。3300029‑7Q化学发光成像系统购于上海勤翔科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养

将肺鳞癌H226细胞于液氮罐中取出，37℃水浴融化，用1 mL移液枪快速将细胞吸到提前准备好的15 mL的离心管中，然后于低温离心机中1 000 r/min离心2 min，去除培养基。同时于离心管中加入4 mL新鲜培养基，用移液枪吹打培养基，使H226细胞均匀分布，转入25 mL培养瓶中,放置于37℃5%（φ）CO2培养箱中。24 h后，在同一时间点更换新鲜培养液。待细胞铺满培养皿80%~90%以上时，进行传代。

2.2 MTT法检测细胞存活率

采用MTT法检测GKT137831对肺鳞癌细胞生存的影响。将H226细胞消化并计数，以每孔4 000个细胞接种于96孔板中。待细胞贴壁后，用GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）分别处理肺鳞癌H226细胞24 h、48 h和72 h、用紫杉醇（0、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L）处理H226细胞48 h，并选取合适浓度的紫杉醇与GKT137831联用处理48 h。药物干预结束后，加入浓度为0.5 mg/mL的MTT，每孔加20μL并在37℃下避光孵育4 h。最后，吸去96孔板中液体，每孔加入二甲基亚砜150μL，并用酶标仪在570 nm处测量每个孔的吸光度（A）值。细胞存活率=（实验组A值−对照组A值）/对照组A值×100%。

2.3 Annexin V‑FITC/PI法检测细胞凋亡

用细胞凋亡Annexin V‑FITC和碘化丙啶（PI）双染测定试剂盒染色，并通过流式细胞仪检测细胞凋亡。将H226细胞接种于60 mm培养皿中，待细胞贴壁后给予不同浓度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）处理24 h。药物干预结束后，用不含EDTA胰酶消化并收集细胞。PBS重悬2次后，加入Annexin V结合缓冲液并在避光条件下用5.0μmol/L Annexin V‑FITC孵育15 min，然后加入10.0μmol/L碘化丙啶（PI）避光孵育5 min。用流式细胞仪进行分析。

2.4 Real‑time qPCR法检测IL‑6 mRNA的表达

采用Real‑time qPCR法检测IL‑6 mRNA的表达。将肺鳞癌H226细胞消化并接种于小皿中，待细胞贴壁后用不同浓度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）处理12 h。药物干预结束后，使用试剂盒从细胞中提取总RNA，然后根据说明书要求，使用Rever Tra Ace逆转录酶合成互补DNA（cDNA）。按照SYBRGreen实时PCR预混液在iCycler（Bio‑Rad）上进行RT‑PCR。引物序列如下：IL‑6上游引物：5’‑GGTGTTGCCTGCCTTCC‑3’；IL‑6下 游 引 物：GTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC‑3’；GAPDH上 游 引 物：5’‑GGCACCGTCAAGGCTGAGAAC‑3’；GAPDH下游引物：5’‑CATGGTGGTGAAGAC‑GCCAGTG‑3’。

使用2−ΔΔCt方法计算每次扩增的基因表达水平，并对GAPDH的mRNA进行标准化。

2.5 Western blot法检测蛋白表达

用Western blot法检测肺鳞癌H226细胞中p‑Jak2、Jak2、p‑Stat3、Stat3、Bcl‑2、Bax蛋白的表达水平。将肺鳞癌H226细胞接种于小皿中，待细胞贴壁后用不同浓度GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）处理12 h。药物干预结束后加入细胞裂解缓冲液与0.5%蛋白酶抑制剂混合物获得全细胞提取物。经过电泳、电转及封闭的过程后，分别在4℃下孵育抗体过夜，二抗孵育1 h，显色。

2.6 统计学方法

实验所得数据计量资料以均数±标准差（±s）表示，应用GraphPad Prism 7.01软件，采用Student’s test检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 GKT137831对肺鳞癌H226细胞存活率的影响

MTT实验结果显示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）给药干预肺鳞癌H226细胞24 h、48 h和72 h后可呈时间和剂量依赖性抑制肺鳞癌H226细胞的存活，见图1。

图1 GKT137831对肺鳞癌H226细胞存活率的影响Figure 1 Effect of GKT137831 on the survival of lung squa‑mous cell carcinoma H226 cells

3.2 GKT137831对肺鳞癌H226细胞凋亡的影响

采用Annexin V‑FITC/PI法检测细胞凋亡，结果显示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）给药干预24 h后呈剂量依赖性诱导H226细胞凋亡（见图2A）。Western blot实验结果显示，GKT137831呈剂量依赖性减少抗凋亡蛋白Bcl‑2的表达量及增加促凋亡蛋白Bax的表达量（见图2B和图2C）。

图2 GKT137831对肺鳞癌H226细胞凋亡及相关凋亡蛋白的影响Figure 2 Effect of GKT137831 on apoptosis and apoptosis related proteins of lung squamous cell carcinoma H226 cells(n=3)

3.3 GKT137831对肺鳞癌H226细胞中IL‑6 mRNA表达的影响

Real‑time qPCR实验结果显示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）给药干预12 h后呈剂量依赖性降低肺鳞癌H226细胞中IL‑6 mRNA的表达水平（P<0.05），见图3。

图3 GKT137831对肺鳞癌H226细胞中IL‑6 mRNA表达的影响Figure 3 Effect of GKT137831 on the expression of IL‑6 mRNA in lung squamous cell carcinoma H226 cells

3.4 GKT137831对肺鳞癌H226细胞Jak2/Stat3通路的影响

Western blot实验结 果显示，GKT137831（0、5.0、10.0、20.0μmol/L）给药干预12 h后呈剂量依赖性减少肺鳞癌H226细胞中磷酸化Jak2、磷酸化Stat3，见图4A~图4C。

图4 不同浓度GKT137831对肺鳞癌H226细胞中Jak2/Stat3通路蛋白表达的影响Figure 4 Effect of GKT137831 on the expression of JAK2/STAT3 pathway protein in lung squamous cell carcinoma H226 cells(n=3)

3.5 GKT137831对紫杉醇的增敏作用

MTT实验结果显示，用不同浓度紫杉醇（0、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L）给药干预48 h后，紫杉醇可呈剂量依赖性抑制肺鳞癌H226细胞的存活率（见图5A)。此外，本研究选取10.0μmol/L GKT137831和20.0 μmol/L紫杉醇作为联合用药的浓度，结果表明，与单独用药组相比，联合用药组更显著抑制肺鳞癌H226细胞的存活（P<0.05），见图5B。

图5 GKT137831对紫杉醇的增敏作用Figure 5 Sensitization of GKT137831 to paclitaxel

4 讨论

既往研究表明，NOX与癌症的发生发展密切相关，抑制NOX的活性能够抑制肿瘤生长并促进癌细胞的死亡[3]。此外，研究证实NOX4在NSCLC中高表达，且在不同层次上证实其可通过激活ROS/PI3K/Akt信号通路促进NSCLC增殖[13]。而在NSCLC中，肺鳞癌目前现有化疗效果较差，治疗方案有限，预后不良。故急需要探索新的更加有效的抗肺鳞癌药物以及治疗方案。本研究发现GKT137831可呈时间和剂量依赖性抑制肺鳞癌H226细胞的存活，并且可呈剂量依赖性诱导肺鳞癌H226细胞凋亡，同时减少抗凋亡蛋白Bcl‑2的表达量及增加促凋亡蛋白Bax的表达量。

目前已证实在肺腺癌A549细胞中，NOX4过表达能提高IL‑6自分泌水平[6]。但目前尚未有研究报道肺鳞癌细胞中NOX4抑制剂GKT137831是否能够影响IL‑6的表达。本研究发现，GKT137831可呈剂量依赖性降低IL‑6 mRNA的表达水平。体内外实验表明IL‑6可促进NSCLC细胞增殖，这一效应主要通过激活Jak2/Stat3信号通路而产生[7,9]。Jak2/Stat3信号通路是近年来发现的一条与细胞增殖、肿瘤发生发展密切相关的信号通路。通过阻断Jak/Stat3信号通路的传导能够诱导癌细胞凋亡[14]。本研究结果显示，GKT137831可呈剂量依赖性减少磷酸化Jak2、磷酸化Stat3。因此GKT137831可能通过降低IL‑6的表达从而抑制Jak2/Stat3信号通路来诱导肺鳞癌细胞凋亡。

紫杉醇是晚期肺癌治疗的常用化疗药物，但众多患者对紫杉醇的敏感性不高[15],联合用药是目前解决病人对紫杉醇敏感性下降的主要手段之一[16]。本研究结果表明，与单独用药组相比，GKT137831与紫杉醇联合使用，对肺鳞癌H226细胞存活的抑制显著增强，故GKT137831能增强紫杉醇的敏感性。但GKT137831增强紫杉醇敏感性的机制仍需进一步深入研究。

综上所述，NOX4抑制剂GKT137831能诱导肺鳞癌细胞凋亡并增强紫杉醇的敏感性，且其诱导肺鳞癌H226细胞凋亡可能与抑制IL‑6/Jak2/Stat3信号通路有关。本研究结果提示，GKT137831可能在肺鳞癌的治疗中发挥重要作用，为临床抗肺鳞癌提供了依据。