黄连素通过调控Hippo信号通路抑制人胃癌细胞系HGC‑27的机制研究

王思敏，陈紫航，罗雪霞，杨艳红，雷自立

[1.广东药科大学附属第一医院（临床医学院），广东广州 510080；2.广东药科大学中医药研究院，广东广州 510006]

胃癌（gastric cancer,GC）已成为威胁全球健康的主要疾病之一，根据报道，2018年全球胃癌新发病例约为103万，在全部恶性肿瘤中排名第5[1],胃癌在东亚地区特别是中国发病率极高[2]。尽管在过去几年，胃癌的存活率有所提高，但预后仍不容乐观，大大降低了人们的生活质量，加重了家庭负担[3]。胃癌主要治疗方法有手术、放疗、化疗等[4‑5]，化疗通常有较大不良反应。因此，需要寻找更多具有抗肿瘤潜能的药物。

黄连素（berberine,BBR）是一种生物活性碱，其成分主要是小檗碱，可以从我国传统中药黄连、黄柏等中提取[6]。黄连素在临床上多用来治疗腹泻和胃肠炎症[7]，近几年发现黄连素有抗炎、抗氧化和器官保护作用，在肝癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤中有明显的抗肿瘤作用[8‑10]，但目前黄连素与胃癌相关的研究不多，黄连素抑制胃癌的机制尚不完全清楚。本实验室前期研究工作发现黄连素可以通过调控增殖、凋亡、坏死、自噬及细胞连接相关基因的表达发挥抑制胃癌细胞的作用，进一步采用miRNA测序和RNA测序方法建立了黄连素处理SGC‑7901的miR‑NA和mRNA表达谱,在RNA测序中鉴定出1 960个上调基因和4 837个下调基因；Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析表明，这些差异表达的基因与癌症和代谢等途径有关，进一步分析了细胞周期、凋亡、炎症、代谢、细胞连接、乙酰化过程等基因的miRNA‑mRNA调控网络，在黄连素处理的SGC‑7901细胞中发现了一些新的抗肿瘤途径，提示黄连素有可能通过调控Hippo信号通路发挥抑制肿瘤的作用[11]。

Hippo信号通路作为近年来新发现的一条通路，在器官发育调控方面起重要作用，越来越多的研究表明Hippo信号通路在多种癌症包括胃癌的发生发展中起着关键作用[12]。幽门螺旋杆菌感染是近年来公认的重要胃癌危险因素之一，Amieva MR等[13]报道在胃炎和幽门螺旋杆菌感染患者中往往有细胞间连接失调，导致Hippo信号通路紊乱，加大了胃癌的患病风险。miR‑375是一种能抑制胃癌的microRNA，异位表达的miR‑375在体内外均能抑制胃癌细胞的生长，Kang等[14]发现Hippo通路中3个组分YAP1、TEAD4和CTGF的表达水平与miR‑375的表达水平呈负相关，是miR‑375的直接靶点。有关Hippo信号通路在胃癌中发挥重要作用的报道不少，但此前未见关于黄连素通过调控Hippo信号通路发挥抑制胃癌作用的类似报道。本实验室前期工作通过RNA测序提示黄连素可能通过调控Hip‑po信号通路发挥抑制胃癌的作用，本研究进一步利用人胃癌细胞系HGC‑27验证黄连素通过调控Hip‑po通路作用抑制胃癌的分子机制，为黄连素在胃癌临床防治中的潜在应用提供更充足的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 人胃癌细胞系HGC‑27（中国科学院上海细胞库）；黄连素（碧云天生物技术公司，质量分数≥98%，相对分子质量371.82）；DMSO（广州瑞舒生物科技有限公司）；10%（φ）胎牛血清、RP‑MI1640培养基、胰酶以及PBS缓冲溶液（美国Hy‑Clone公司）；Trizol、反转录试剂盒（日本Takara公司）；DEPC·H2O、引物（上海生工生物工程股份有限公司）；氯仿、异丙醇（天津市大茂化学试剂厂）；生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；超微量紫外分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；Piko‑Real 96型Real‑time PCR仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与药物处理 人胃癌细胞HGC‑27常规置于1640完全培养基，内含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，在37°C、5%（φ）CO2条件下培养。将对数生长期的胃癌细胞消化计数，以1×105/孔接种于6孔板中，将细胞分为3组：对照组、黄连素5μmol/L浓度组和黄连素10μmol/L浓度组。将黄连素溶于DMSO，配制浓度为5μmol/L和10μmol/L的黄连素。待细胞长至80%~90%时弃培养液，每孔加入新鲜的培养基2 mL，对照组、黄连素5μmol/L浓度组和黄连素10μmol/L浓度组分别加入20μL DMSO、5μmol/L和10μmol/L黄连素，继续培养，24 h后收集细胞。

1.2.2 利用Real‑time PCR检测Hippo信号通路重要基因的表达水平 对照组及黄连素组的细胞弃上清，用PBS清洗3遍。加入RNA裂解酶Trizol裂解。裂解液经氯仿抽提（每1 mL Trizol加0.2 mL）、异丙醇沉淀（每1 mL Trizol加入0.5 mL）、75%（φ）乙醇（每1 mLTrizol加入1 mL）洗盐，沉淀干燥后以适量DEPC‑H2O溶解，紫外分光光度计测吸光度（A）值，−80℃保存。反转录按PrimeScript RT reagent Kit说明书操作，得到cDNA作为Real‑time PCR反应的模板。根据NCBIGene网页公布的基因序列，利用NCBI在线引物设计软件设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体引物序列见表1。使用Thermo Piko Real‑time PCR系统，10μL反应体系包括:上下游引物（10μmol/L）各0.2μL，cDNA模板（100 ng）1μL，SYBR Green反应液5μL，dH2O补齐至10μL。PCR循环参数为:95°C预变性30 s，95°C 45 s，60°C 20 s，65°C 15 s，40个循环。采用标准曲线法分析数据，GAPDH作为内对照,检测黄连素处理后Hippo信号通路关键基因表达水平的变化，融解曲线用来保证扩增产物的特异性。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.2.3 利用Western blot检测Hippo信号通路重要蛋白的表达水平 用1×PBS充分洗涤细胞，再用裂解液（按RIPA∶蛋白酶抑制剂=100∶1的体积比）裂解细胞抽提总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取20μg总蛋白上样，进行SDS‑PAGE凝胶电泳，转PVDF膜，脱脂牛奶封闭1 h后加入一抗。电转后的PVDF膜用含5%BSA的TBST封闭1 h，再分别加入相应的一抗，4℃孵育过夜。次日，经TBST（10 min×3次）洗涤后，分别加入相应辣根过氧化物酶（horse‑radish peroxidase，HRP）标记的二抗室温孵育1 h。使用ECL化学发光试剂显影，以GAPDH为内参，利用image Lab和image J计算灰度值，对目的蛋白表达量进行分析。抗体信息见表2。

表2 抗体信息Table2 Antibody information

1.2.4 统计分析 所有实验重复3次，计量资料以±s表示。使用SPSS16.0软件进行统计学分析，正态分布变量多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄连素对HGC‑27细胞形态学的影响

黄连素处理24 h后镜下可观察到，视野中黄连素5、10μmol/L组贴壁细胞数量明显减少，有些出现了空泡，悬浮细胞增加（见图1），提示黄连素对HGC‑27胃癌细胞有抑制作用。

图1 黄连素对HGC‑27细胞形态的影响Figure 1 Effect of berberine on the morphology of HGC‑27 cells

2.2 黄连素对HGC‑27胃癌细胞中Hippo通路相关分子mRNA表达水平的影响

与对照组相比，黄连素组中TEAD3（5μmol/L组P<0.05；10μmol/L组P<0.01）、TEAD4（5μmol/L组P<0.05；10μmol/L组P<0.01）、YAP（10μmol/L组P<0.01）及CyclinE1（10μmol/L组P<0.01）表达水平显著下降，呈浓度依赖性的趋势；MST1表达水平显著高于对照组（10μmol/L组P<0.05）。见图2。

图2 利用Real‑time PCR检测黄连素处理后HGC‑27细胞中Hippo信号通路基因表达的影响Figure 2 Effect of berberine on the expression of Hippo signaling pathway genes in HGC‑27 cells detected by real‑time PCR

2.3 黄连素对HGC‑27胃癌细胞中Hippo通路相关分子蛋白表达水平的影响

进一步利用Western blot检测了MST1、YAP、TEAD3、TEAD4及CyclinE蛋白的表达水平。与对照组相比，黄连素组中TEAD4（5μmol/L组P>0.05；10μmol/L组P<0.05）、YAP（5μmol/L组P>0.05；10μmol/L组P<0.01）及CyclinE1（10μmol/L组P<0.01）表达水平显著下降，TEAD3表达水平有降低趋势，但差异无统计学意义；MST1和p‑YAP表达水平显著升高（10μmol/L组P<0.05），p‑MST1表达水平也呈现上升趋势，但差异无统计学意义。见图3和图4。

图3 Western blot检测黄连素处理后HGC‑27细胞中Hippo信号通路蛋白表达的影响Figure 3 Effect of berberine on the expression of Hippo signaling pathway proteins in HGC‑27 cells detected by western blot

图4 利用灰度计算黄连素处理后HGC‑27细胞中Hippo信号通路蛋白表达的影响Figure 4 Effect of berberine on the expression of Hippo signaling pathway proteins in HGC‑27 cells by gray calculation

3 讨论

在肿瘤化疗治疗中，寻找高效低毒且多靶点的药物已成为研究热点[5,15],而黄连素作为一种多年来在临床中应用于胃肠道炎症的中药，目前发现有抗肿瘤的作用[16]。

Hippo通路研究始于1994年果蝇wts基因的发现[17]，故以果蝇ste‑20样激酶Hippo命名。研究表明Hippo信号通路在细胞增殖与分化、组织损伤再生、肿瘤发生和发展过程中起重要作用，并参与肠道中众多生理及病理进程的调控[18]。Hippo信号通路包括上游调节分子、核心分子及主要的下游效应分子3部分，其核心激酶链包括MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOB1等，而YAP/TAZ为主要的下游效应分子[19]。Hippo信号通路受到机械环境、G蛋白耦联受体信号、细胞能量水平、氧化应激和缺氧等多种信号调控，当Hippo信号通路被激活时，MST1/2在支架蛋白SAV1的协助下，磷酸化MOB1和LATS1/2并加强它们之间的相互作用，磷酸化的LATS1/2被激活，然后在多个位点上磷酸化YAP/TAZ，磷酸化的YAP/TAZ滞留在细胞质中，被泛素化降解，从而抑制细胞生长、增殖和诱导细胞凋亡[18]。当Hippo信号通路受到抑制时，YAP去磷酸化后进入细胞核中，主要与TEAD家族的DNA结合因子配对，通过调控细胞周期蛋白CyclinE、结缔组织生长因子CT‑GF等基因的表达来刺激细胞增殖[20]。Hippo信号通路失调会导致细胞过度增殖，与癌症的发生和发展密切相关[21]。

蛋白激酶（mammalian sterile 20‑like kinase1/2，MST1/2）是体内普遍表达的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，可在外界刺激下参与细胞凋亡，是哺乳动物中重要的抑癌基因[22]。MST1/2基因全身敲除的小鼠胚胎中，往往有肝脏、心脏、胃和脾的急剧过度生长[23]。与正常胃黏膜相比，胃癌组织中的MST1/2水平通常降低[24]。本实验用黄连素处理HGC‑27细胞系24 h后，MST1基因表达水平显著上升，Western blot结果表明磷酸化和非磷酸化MST1蛋白水平表达上调，说明黄连素可通过激活MST1的表达来抑制肿瘤的生长，诱导胃癌细胞凋亡。

Yes相关蛋白（Yes‑associated protein，YAP）是一种转录共激活因子，是Hippo信号通路的一个关键蛋白，最近研究表明，YAP和许多癌症的启动和实体瘤增长有关[25‑26]。在胃癌黏膜中Hippo通路的YAP表达水平明显高于其在正常胃黏膜中的表达水平，在胃癌MKN‑28/74细胞系中敲除YAP基因，细胞的增殖侵袭能力下降[27]。这些均提示Hippo通路通过YAP这一转录调控因子对胃癌具有一定影响。本研究结果表明，与对照组相比，黄连素处理后的HGC‑27胃癌细胞中YAP的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。随着黄连素浓度升高，YAP磷酸化失活，p‑YAP蛋白表达水平上调，而YAP表达水平则下降。这表明黄连素有可能通过激活Hippo通路中的关键下游效应因子YAP，使其磷酸化后被泛素化降解，无法进入细胞核发挥作用，从而抑制了下游相关增殖、生长基因的表达。

TEA domain transcription factors（TEAD）是YAP在下游调控基因转录的关键分子，在细胞增殖再生和组织内稳态中发挥着重要作用[28]。Guan实验室对人类转录因子库进行筛选，发现TEADs可作为YAP激活最强的转录因子[29]。VGLL4与TEAD竞争结合YAP阻碍TEAD的激活，抑制胃癌细胞的生长[30]。Jiao等[31]通过转染TEAD4突变体破坏DNA结构，阻碍YAP诱导的TEAD4激活和靶基因转录，抑制胃癌细胞HGC‑27的生长和集落形成。本研究检测到黄连素处理组TEAD3和TEAD4的mRNA和蛋白表达水平均显著下降，证明黄连素有可能是通过YAP磷酸化降解、抑制TEADs，从而抑制胃癌HGC‑27细胞的生长。

CyclinE是G1期细胞周期增殖信号的蛋白，过表达促使细胞过度增殖而发生癌变[32]。YAP通过直接靶向细胞周期蛋白调节细胞周期，加速细胞分裂[17]。Zhang等[33]通过Oncomine、The Cancer Genome Atlas datasets等基因库的数据分析，发现Cyclin家族的高表达往往与胃癌患者的不良预后紧密相关，其中胃癌组织CyclinE的mRNA水平往往高于正常胃组织。前期实验室研究结果发现黄连素将MCF‑7细胞明显阻滞在细胞周期G1期[11]。在本研究中，CyclinE1表达水平的下降表明黄连素的抗肿瘤作用与调控Hippo通路有关。

本实验室前期工作通过生物信息学分析预测到黄连素可能通过调控Hippo信号通路这一潜在靶点抑制胃癌细胞的增殖，为了进一步阐明黄连素抗肿瘤作用的分子机制，本研究利用Real‑time PCR和Western blot检测了黄连素处理人胃癌细胞HGC‑27中Hippo信号通路中的重要分子MST1、YAP、TEAD3、TEAD4和CyclinE1等的表达水平，发现在胃癌细胞HGC‑27中黄连素通过促进MST1磷酸化激活Hippo信号通路，进而磷酸化关键效应因子YAP，使其失活，并且降低了TEAD4、YAP的靶基因CyclinE1的表达水平，从而抑制了胃癌细胞的增殖和侵袭。本研究探讨了黄连素通过调控Hippo信号通路抑制胃癌细胞的分子机制，为黄连素在胃癌临床治疗方面的潜力和机制提供了一定的理论基础，也为胃癌治疗和预后的分子机制提供了新靶点。