UPLC-Q-TOF法测定大鼠血清中苏格木勒-3水提物胡椒碱的浓度及其药动学研究*

萨日呼，乌力吉，解秀花，萨础拉

(内蒙古医科大学蒙医药学院，呼和浩特 010110)

蒙药苏格木勒-3汤始载于《四部医典》[1]，为蒙医临床常用主治失眠方剂，由白豆蔻15 g、香旱芹10 g、荜茇5 g组成，其味辛，性温，具有抑赫依作用。目前在临床广泛应用于治疗失眠症等。课题组前期将蒙药苏格木勒-3汤分为水提物与挥发油部位进行了广泛地研究。在完成苏格木勒-3水提物血清药物化学研究的过程中笔者发现，口服苏格木勒-3水提物后，大鼠血清中检测到胡椒碱，且在大鼠脑组织中也检测到了胡椒碱。目前已发现胡椒碱具有抗氧化[2]、抗肿瘤[3]、镇静、抗惊厥[4]、抗抑郁[5]等诸多药理作用。推测胡椒碱为苏格木勒-3潜在的有效物质，但是苏格木勒-3水提物中胡椒碱的药动学特征尚未明确。因此，为了揭示苏格木勒-3水提物中胡椒碱的药动学特征，并了解其体内的吸收、分布、代谢及排泄过程，且为苏格木勒-3的进一步开发研究提供科学的体内研究数据。为此，本文首先建立胡椒碱的检测方法，并将该法用于研究给予苏格木勒-3水提物后大鼠体内胡椒碱的药动学。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂 胡椒碱对照品(批号：110775-201706，中国食品药品检定研究院，含量≥98%)；维拉帕米(批号：110788-201707，中国食品药品检定研究院，含量≥98%)；甲醇(批号：CAS67-56-1，含量≥99.9%)、乙腈(批号：LOT190882，含量≥99.9%)均为色谱纯(Fisher)；水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

苏格木勒-3水提物、荜茇水提物由内蒙古医科大学蒙医药学院蒙药炮制实验中心提供，苏格木勒-3中各单味药材：白豆蔻、香旱芹与荜茇(内蒙古天立药材公司)。经内蒙古医科大学蒙医药学院图门巴雅尔教授鉴定：白豆蔻为姜科植物白豆蔻AmomumkravanhPierreexGagnep和爪哇白豆蔻AmomumcompactumSoland.exMaton的果实(产地：广西，安国路路通中药饮片有限公司，批号：1606021)；白豆蔻含量符合《中华人民共和国药典》2015年版的要求；香旱芹为伞形科植物孜然芹CuminumcyminumL.的成熟果实(产地：新疆，安国路路通中药饮片有限公司，批号：150401)；荜茇为胡椒科植物荜茇(PiperlongumL.)的干燥未成熟或成熟的果穗(产地：湖南，安国路路通中药饮片有限公司，批号：150401)；荜茇符合《中华人民共和国药典》2015年版的要求。

1.1.2仪器 Waters ACQUITY UPLC超高液相系统，Waters Xevo G2-XS Tof[沃特世科技(上海)有限公司]；Biofuge primo R台式离心机(美国Thermo公司)；Sartorious BT 25S型1/100000电子分析天平(感量：0.001 mg，北京赛多利斯仪器有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；GENIE微型旋涡混合仪(美国)。

1.1.3实验动物 健康雄性SD大鼠6只，体质量220～260 g，由北京海淀区兴隆动物实验繁殖中心提供，合格证编号：SCXK(蒙)2002-0001，饲养室相对湿度40%～50%，温度(24±2) ℃，明暗12 h交替环境中适应7 d。

1.2方法

1.2.1色谱条件 液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm)色谱柱(Waters公司)；流动相甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)。A：B=70%：30%。流速：0.4 mL· min-1。柱温30 ℃，进样量为：2 μL。

质谱条件：离子源ESI+，正离子模式检测，多反应离子监测(MRM)，胡椒碱母离子m/z286，子离子m/z201，锥孔电压80 V，碰撞电20 V。维拉帕米母离子m/z455，子离子m/z165，锥孔电压80 V，碰撞电20 V。毛细管电压2.98 kV，离子源温度130 ℃，干燥器温度449 ℃，干燥气流速99 L· h-1。

1.2.2对照品储备液的制备 精密称取胡椒碱对照品适量，甲醇溶解，配成20.36 μg·mL-1储备液，置4 ℃冰箱中储存。

1.2.3内标物储备液的制备 精密称取维拉帕米内标物适量，甲醇溶解，配成5.08 μg·mL-1的储备液，置4 ℃冰箱中储存。

1.2.4血清样品的预处理 精密吸取内标物10 μL于具塞离心管中，加入大鼠血清样品200 μL，加乙腈800 μL，涡旋5 min，12 000 r· min-1(r=0.25 cm)离心15 min，取上清液于40 ℃氮吹流吹干，残渣用100 μL流动相溶解，12 000 r· min-1离心15 min，进样分析。

1.2.5药动学实验

①苏格木勒-3水提物的制备 称取备用的苏格木勒-3汤(白豆蔻：香旱芹：荜茇=3：2：1)50 g，加纯化水1000 mL，煎煮30 min后，滤过，滤液蒸干，苏格木勒-3得率为：18%。

②药动学实验 取SD大鼠，给药前禁食不禁水12 h，按临床剂量40倍给药灌胃给予苏格木勒-3水提物3.96 g·kg-1，给药后10，20，30 min，1，2，4，6，8，12，24 h由大鼠眼底静脉丛采血约2 mL，3000 r·min-1(r=0.5 cm)离心15 min，分离血清，-80 ℃冷冻储藏。

2 结果

2.1专属性实验 空白血清、空白血清+胡椒碱、胡椒碱对照品+内标物+空白血清、给药后30 min的含药血清多反应监测色谱图见图1。由图1可知，血清中的内源性物质不干扰胡椒碱和内标物的测定。胡椒碱与内标物的保留时间分别为5.69和2.95 min。

2.2标准曲线的制备 取空白血清，稀释胡椒碱对照品储备液，按血清样品处理方法操作，配制成相当于胡椒碱为20.272，10.136，5.068，2.534，1.267，0.633 5，0.032，0.015 μg ·mL-1的血清对照样品溶液，建立标准曲线。以胡椒碱浓度为横坐标，以胡椒碱与内标物的峰面积比值作为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。回归方程为：Y=0.087 1X+0.005 8，R2=0.999 4，胡椒碱在0.015～20.272 μg·mL-1线性良好。胡椒碱的定量下限为0.015 μg·mL-1

A.PCPA大鼠空白血清加胡椒碱对照品；B.胡椒碱对照品+内标+空白血清；C.苏格木勒-3水提物含药血清样品；1.维拉帕米；2.胡椒碱。

。

2.3准确度与精密度考察 取空白血清按“标准曲线制备”项下的方法分别制备低、中、高浓度(胡椒碱0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)质量控制样品，每个质量浓度进行6个样本分析，连续测定3 d，求得方法的准确度与精密度(RSD)[6]，结果见表1。

表1 大鼠血清中胡椒碱准确度、精密度、基质效应实验结果

2.4基质效应 精密加入低、中、高浓度对照品溶液及内标溶液各10 μL，复溶到100 μL，涡旋3 min，12000 r·min-1(r=0.25 cm)，离心15 min，按“2.1”色谱条件下进行测定，峰面积为A1，按“2.4”项下方法提取空白血清，离心浓缩后同法操作，峰面积为A2，计算基质效应，公式为基质效应=A2/ A1×100%，结果见表1，可知内源性物质对胡椒碱无影响。

2.5胡椒碱提取回收率 在空白血清中加入已知量的胡椒碱对照品，制成低、中、高浓度(胡椒碱0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)的质量控制样品，进行样品处理，测定。另取空白血清样品，样品处理，离心后得上清液，分别加入上述相应质量浓度的对照品溶液，经过处理后测定。以2种方法测得的胡椒碱峰面积比值计算提取回收率，回收率为70% ～85%。

2.6胡椒碱稳定性考察 在空白血清中加入已知量的胡椒碱对照品，制成低、中、高浓度(胡椒碱0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)的质量控制样品各3样本，考察样品在室温放置24 h、-20 ℃保存30 d，经历3个冷冻-解冻循环下的稳定性[7]，结果表明胡椒碱在上述条件下均稳定。结果见表2。

2.7苏格木勒-3水提物中胡椒碱大鼠血清药动学研究 取“1.2.4”项下制备血清样品，在拟定色谱条件下进样分析。以血药浓度对时间作图，采用药动学软件对胡椒碱在大鼠体内的血药浓度时间曲线进行拟合，结果见图2，其主要的药动学参数见表3。

表2 大鼠血清中胡椒碱稳定性考察

表3 苏格木勒-3水提物中胡椒碱的药动学参数

图2 大鼠血清中胡椒碱药物浓度-时间曲线

3 讨论

近几年来，胡椒碱的药动学研究报道较多，钟峰等[8]采用HPLC法测定了大鼠血浆中胡椒碱的血药浓度并进行了药动学研究。当HPLC法测定血浆中药物成分浓度时，缺点在于灵敏度较低，无法测得血药浓度较低样品，从而影响了数据的准确性。因此，本文采用UPLC-Q-TOF法测定了胡椒碱的血药浓度。实验比较了胡椒碱在正离子和负离子两种检测方式下的响应，结果用负离子检测时胡椒碱信号响应很弱，而采用正离子检测则信号强度较大，故选择了在正离子模式下测定。

本文在考察血清样品处理方法时选用了固相萃取与有机溶剂除去蛋白的方法，结果发现乙腈除蛋白的预处理效果较好。在选用乙腈除蛋白的方法时，又考察了血清样品与乙腈比例1：2、1：3、1：4时除蛋白效果，1：4时除蛋白效果最好。

药动学研究结果表明：苏格木勒-3水提物中胡椒碱在正常大鼠体内血药浓度于4 h内才达到峰值，半衰期也较长。下一步，笔者将与荜茇单药中胡椒碱的数据进行比对。综上所述，本文揭示了苏格木勒-3水提物中胡椒碱的药动学特征，为其进一步开发研究提供了科学的体内研究数据。