lncRNA LINC00858靶向微小RNA-363-3p促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭
2021-07-28杨隆良马瑜郭虎林
杨隆良，马瑜，郭虎林
肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，对于不适合手术切除的晚期肝癌病人，分子靶向药物的出现为肝癌的治疗提供了新的选择。研究表明，lncRNA 参与多种肿瘤的发生、发展及预后，与肝癌也密切相关。LINC00858在结直肠癌组织和细胞系中均上调表达，LINC00858高表达与晚期临床进展和不良预后显著相关；敲低LINC00858可抑制结直肠癌细胞的增殖，迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。LINC00858 在骨肉瘤组织和细胞系中也显著上调表达，沉默LINC00858 对骨肉瘤细胞的体外增殖、侵袭能力和体内肿瘤生长均有抑制作用。然而LINC00858 在肝癌中的表达及其对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响和机制尚不清楚。研究显示，肝癌中miR-363-3 的低表达与肿瘤大小、淋巴结转移和静脉浸润有关；miR-363-3p 的上调抑制了肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭。miR-363-3p 过表达抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。敲低 lncRNA MALAT1 可通过上调miR-363-3p 调 节 EZH2 抑 制 结 直 肠 癌 发 展。 但LINC00858 在肝癌中的作用及其机制是否与miR-363-3p 有关还尚未可知。因此，本研究分析了LINC00858 对肝癌细胞生物学行为的影响，并以miR-363-3p为切入点分析其抗肿瘤机制。
1 材料与方法
1.1 临床标本
选取 2017 年 1 月至 2019 年 1 月青海省第五人民医院收治的肝癌病人30例，获取其肝癌组织及其癌旁组织。病人术前未进行过放化疗，所有病人均知情且同意。癌旁组织为距离癌组织边缘2～5 cm处组织。1.2 细胞与主要试剂
肝癌细胞株HCCLM3 购自南京森贝伽生物科技有限公司。qRT-PCR 试剂盒、反转录试剂盒、Trizol 试剂购自日本Takara 公司；CCK-8 试剂盒购自杭州仟诺生物科技有限公司；Matrigel胶、Transwell小室购自上海恒斐生物科技有限公司；双荧光素酶报告检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；二辛可宁酸（BCA）试剂盒、RIPA蛋白裂解液购自上海羽朵生物科技有限公司；CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9 单抗、GAPDH 抗体及山羊抗兔IgG-HRP购自北京百奥莱博科技有限公司。1.3 细胞培养与分组
在95%湿度、5%二氧化碳、37 ℃环境条件下，用含 10%FBS 的 DMEM 培养基培养肝癌HCCLM3 细胞，取对数生长期HCCLM3 细胞 ，将 pcDNA、pcDNA-LINC00858、si-NC、si-LINC00858 转 染 至 HCCLM3 中 ，记 为 pcDNA 组 、pcDNA-LINC00858 组、si-NC 组、si-LINC00858 组；将si-LINC00858 与 anti-miR-NC 共转染至 HCCLM3 中，记为 si-LINC00858+anti-miR-NC 组，将 si-LINC00858与anti-miR-363-3p 共转染至HCCLM3 中，记为si-LINC00858+anti-miR-363-3p组。1.4 RT
-qPCR 检
测
LINC00858 和
miR
-363
-3p 表达水平
提取细胞总RNA，反转录为cDNA，LINC00858、miR-363-3p 分别以GAPDH、U6 为内参，相对表达量用 2法计算。LINC00858 正向引物序列：5'-CCCAGCTCCTTACACACGTT-3'，反向引物序列：5'-TTCAGAGGCCTGCATCACTG-3'；miR-363-3p 正向引物序列：5'-CGAATTGCACGGTATCCATCT-3'，反向引物序列：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；GAPDH 正 向 引 物 序 列 ：5'-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'，反向引物序列：5'-ACCAAATCCGTTGACTCCGA-3'；U6正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。1.5 双荧光素酶报告实验
构建LINC00858 野生型和突变型报告基因载体，并分别转染miR-NC 和miR-363-3p，48 h后，检测荧光素酶活性。1.6 CCK
-8 检测细胞增殖活性
以1×10个/孔接种 HCCLM3 细胞于 96 孔板。37 ℃分别培养24、48、72 h 后，每孔加入 10 μLCCK-8 试剂，检测各组细胞在490 nm处的OD值。1.7 Transwell 检测细胞迁移和侵袭
迁移检测：Transwell上室中加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL DMEM 培养液，培养24 h。细胞侵袭实验：取100 μL用DMEM培养液稀释的Matrigel加到Transwell上室，凝固后，加200 μL细胞悬液于上室，培养24 h。擦去上室表面细胞，4%多聚甲醛固定穿膜细胞30 min，0.1%结晶紫染色30 min。于显微镜下计数。1.8 蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达
提取细胞总蛋白，进行蛋白定量。取等量变性蛋白行SDS-PAGE 电泳，并转至PVDF 膜，25 ℃下用5%脱脂奶粉封闭1 h，按1∶1 000 稀释一抗4 ℃孵育过夜，按1∶2 000 稀释二抗25 ℃孵育1.5 h，显影，定影后，Quantity One软件分析上述蛋白相对表达量。
2 结果
2.1 LINC00858 和miR
-363
-3p 在肝癌组织中的表达
肝癌组织中LINC00858 和miR-363-3p 分别高表达和低表达（P
＜0.05）。见表1。
表1 LINC00858和miR-363-3p在肝癌组织中的表达/
2.2 LINC00858 靶向调控miR
-363
-3p 的表达
如图 1 所示，Starbase 预测到 LINC00858 与 miR-363-3p存在互补核苷酸序列。如表2 所示，荧光素酶报告实验显示，与共转染WT-LINC00858 和miR-NC 相比，共转染WT-LINC00858 和miR-363-3p 的荧光素酶活性显著降低（P
＜0.05）。如表3 所示，过表达或抑制LINC0085 分别下调或上调miR-363-3p 的表达（P
＜0.05）。
表2 荧光素酶活性检测/
表3 LINC00858调控miR-363-3p的表达/
图1 LINC00858与miR-363-3p的结合位点
2.3 抑制LINC00858 表达对肝癌HCCLM3 细胞增殖、迁移侵袭的影响
如图2 和表4 所示，转染si-LINC00858 后，LINC00858、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表达水平降低，细胞活性、迁移、侵袭数降低，p21表达水平升高（P
＜0.05）。
表4 抑制LINC00858表达对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移侵袭的影响/（，n=9）
图2 抑制LINC00858对增殖、迁移侵袭相关蛋白表达的影响
2.4 干扰miR
-363
-3p 表达逆转了抑制LINC00858表达对肝癌HCCLM3 细胞增殖、迁移侵袭的作用
如图 3 和表 5 所示，si-LINC00858 和 anti-miR-363-3p共转染后，miR-363-3p、p21 表达水平降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表达水平升高，细胞活性、迁移数、侵袭数升高（P
＜0.05）。
表5 干扰miR-363-3p逆转了抑制LINC00858对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移侵袭的影响/（，n=9）
图3 干扰miR-363-3p逆转了抑制LINC00858增殖、迁移侵袭相关蛋白表达的影响
3 讨论
肝癌起病隐匿、进展快，病人在确诊时多数已是晚期，传统治疗预后效果差，靶向药物治疗及联合治疗已成为新的治疗趋势，也给病人提供新的选择。研究表明部分异常表达的LncRNA与肿瘤的发生、增殖、转移、预后有关，研究LncRNA在肝癌中的作用机制，可为其早期诊断、选择治疗靶点及预后评估提供帮助。研究报道高表达的LINC00858与差分化，晚期TNM 分期和淋巴结转移相关，LINC00858 外源性过表达促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进肿瘤生长和血管生成。LINC00858通过调控miR-422a促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。LINC00858过表达通过miR-3182/MMP2轴显著促进肺癌细胞增殖、侵袭。然而 LINC00858 在肝癌中的表达及其对肝癌的影响还尚不清楚，本实验检测了肝癌病人组织中LINC00858 的表达水平，结果显示，肝癌组织中LINC00858表达水平显著升高，说明LINC00858与肝癌的进展可能相关。本实验通过转染si-LINC00858抑制LINC00858表达后HCCLM3细胞活性、迁移数、侵袭数降低，表明LINC00858 在肝癌中具有致癌功能。CyclinD1 和p21 是细胞增殖调控的关键蛋白，CyclinD1 可结合细胞周期抑制蛋白依赖性激酶（CDK）促进细胞周期转换发挥促增殖作用，而 p21 具有相反功能。MMP-2 和 MMP-9 是一种明胶酶，其可破坏基底膜，促进细胞局部和远处浸润，是肿瘤细胞侵袭和转移的主要启动子。本研究中抑制LINC00858 表达可上调p21 表达，下调CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达，与其抗增殖、抗迁移、抗侵袭作用吻合，表明抑制LINC00858 表达是控制肝癌转移的潜在靶点。
miRNA表达改变与肿瘤细胞的恶性生物学行为有关，研究报道神经胶质瘤组织中miR-3663-3p表达水平升高，miR-3663-3p通过直接靶向丙酮酸脱氢酶B（pyruvate dehydrogenase B，PDHB）促进神经胶质瘤细胞生长和侵袭。miR-363-3p 通过下调 SOX4 表达抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭。miR-363-3p还通过靶向磷酸肌醇-3-激酶催化亚基α（PIK3CA）抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖，迁移和侵袭并诱导细胞凋亡。表明miR-363-3p在多种肿瘤中充当抑癌基因起作用。但miR-363-3p对肝癌的影响尚不清楚。本实验结果显示，肝癌组织中miR-363-3p 低表达，LINC00858 高表达，且LINC00858 靶向负调控miR-363-3p表达。为验证LINC00858是否通过调控miR-363-3p 影响肝癌的进展，共转染si-LINC00858 和anti-miR-363-3p后，细胞活性、迁移、侵袭数升高，即下调miR-363-3p 逆转了抑制LINC00858 表达对肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
