4种苦参生物碱与洗必泰对变形链球菌的联合作用研究

杨若琪，赵贵萍，王川东，王 静*

（1. 山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2. 云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500；3. 山东大学 微生物技术研究院，山东 青岛 266237）

局部应用化学预防药物（如洗必泰）是目前预防龋齿的主要策略之一[1]。很多市售的口腔护理产品都含有洗必泰，但是抗菌药物的过度使用可能会破坏微生物群落间的生态平衡[2-3]。近年来，个别天然药物能显著增强洗必泰的抗龋活性，降低洗必泰发挥作用的有效浓度，天然药物与常规抗菌药物的联用在龋病防治领域具有潜在的应用前景[4]。

苦参Sophora flavescensAlt.是豆科、槐属草本或亚灌木植物。苦参总碱是苦参中所有生物碱的统称，其主要成分有苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱、槐胺碱、氧化槐果碱等多种生物碱。在本研究中，以苦参总碱中的4种主要生物碱为研究对象，评估对变形链球菌浮游细胞和生物被膜细胞的体外抗菌活性影响。同时分析这4种生物碱与洗必泰对变形链球菌的协同抑制作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

DNM-9602型酶标仪（北京普朗新技术有限公司）；苦参碱（批号：S31035）、氧化苦参碱（批号：S31408）、槐果碱（批号：S31400）、槐定碱（批号：S25721）均购于上海源叶生物科技有限公司；变形链球菌（S. mutans）UA159由山东中医药大学微生物教研室提供；BHI培养基（批号：B8130）购于北京索莱宝生物科技有限公司；MTT （批号：KGT5251）购于江苏凯基生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1药液以及菌液的制备 试验组药物苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱均用100%乙醇作为溶剂配制成200 mg/mL的母液，用BHI培养基进行梯度二倍稀释。阳性对照组药物洗必泰用BHI培养基稀释为2或4 μg/mL，阴性对照组未用药物处理。用接种环将变形链球菌UA159接种于BHI液体培养基中，37℃过夜厌氧培养。

1.2.2浮游细胞的代谢活性 MTT法：使用MTT法测定浮游状态下细菌的代谢活性[5]。将培育至指数生长期的变形链球菌与不同浓度的试验药物于37℃下厌氧孵育24 h。随后通过离心去除上清液，并用BHI培养基将细菌沉淀重悬。加入5 mg/mL的MTT溶液于37℃下在黑暗中孵育4 h。孵育结束后，加入100%的DMSO以溶解产生的甲臜。用酶标仪测定490 nm处的吸光度来评估浮游细胞的代谢活性。每个浓度进行三次生物学重复。

1.2.3生物被膜的形成 结晶紫染色法：在96孔板种进行生物被膜形成实验，通过结晶紫染色进行定量[6]。首先将过夜培养的变形链球菌悬液稀释至1×107cfu/mL，然后接种到含有1%蔗糖的新鲜BHI培养基中。与不同浓度的试验药物于37℃下厌氧孵育24 h后弃去96孔板中的上清液，并用无菌PBS清洗2次。随后将形成的生物被膜用0.4%的结晶紫染色10 min，最后向每个孔中加入33%的冰醋酸溶液。用酶标仪测定595 nm处的吸光度来定量生物被膜的形成。每个浓度进行三次生物学重复。

1.2.4联合用药研究 棋盘法：通过棋盘法分析不同试验药物与洗必泰的协同作用。在96孔板中，试验药物纵向加入，洗必泰横向加入，如前所述分别测定它们对变形链球菌浮游细胞和生物被膜细胞的影响，并计算单独用药和联合用药的抑制率。利用R软件包“synergyfinder”中的零相互作用效能模型（ZIP）进一步评估它们的协同作用[7]。

1.2.5统计学方法 用SPSS 19软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用方差分析，所有试验重复3次。以P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 4种生物碱对变形链球菌浮游细胞代谢活性的影响

4种生物碱的浓度增大，浮游细胞代谢活性都降低，与阴性对照组相比，当苦参碱和氧化苦参碱浓度达到5 mg/mL、槐果碱浓度达到2.5 mg/mL、槐定碱浓度达到1.25 mg/mL时，浮游细胞代谢活性明显降低，差异有统计学意义（P< 0.05）。10 mg/mL的苦参碱、槐果碱和槐定碱降低细胞代谢活性达到约75%，而同浓度的氧化苦参碱降低约20%。另外，与阴性对照组相比，2 μg/mL的洗必泰降低细胞代谢活性约75%，差异有统计学意义（P< 0.01），具体见图1。

图1 4种生物碱对变形链球菌浮游细胞代谢活性的影响Fig.1 Effects of four alkaloids on metabolic activity of S. mutans planktonic cells

2.2 4种生物碱对变形链球菌生物被膜形成的影响

4种生物碱的浓度增大，生物被膜的形成也有所减少，与阴性对照组相比，当苦参碱、槐果碱和槐定碱浓度达到2.5 mg/mL、氧化苦参碱浓度达到5 mg/mL时，生物被膜形成率明显降低，差异有统计学意义（P< 0.05）。20 mg/mL的苦参碱、槐果碱和槐定碱抑制约85%的生物被膜形成，而同浓度的氧化苦参碱抑制约20%。另外，与阴性对照组相比，4 μg/mL的洗必泰抑制约80%的生物被膜形成，差异有统计学意义（P< 0.01），具体见图2。

图2 4种生物碱对变形链球菌生物被膜形成的影响Fig.2 Effects of four alkaloids on biofilm formation of S. mutans

2.3 4种生物碱与洗必泰对变形链球菌浮游细胞代谢活性的协同抑制作用

与单独使用试验药物相比，与洗必泰联合使用可以在不同程度上降低洗必泰的浓度。具体来说，在浓度为0.5 μg/mL时，洗必泰只能抑制浮游细菌约25%的代谢活性，但是与5 mg/mL的苦参碱联合使用时，可以达到约70%的抑制作用。1 μg/mL的洗必泰与槐果碱、槐定碱以及氧化苦参碱联合使用时，对浮游细菌代谢活性的抑制作用从40%增加到70%，见图3。通过零相互作用效能模型（ZIP）进一步分析获得的数据，我们发现这4种生物碱与洗必泰对变形链球菌浮游细胞代谢活性的协同抑制作用强弱依次为：苦参碱（平均协同得分2.5）>槐定碱（平均协同得分2.2） >槐果碱（平均协同得分1.5） >氧化苦参碱 （平均协同得分-2.8），见图4。

图3 4种生物碱与洗必泰对变形链球菌浮游细胞代谢活性的协同抑制作用Fig.3 Synergistic inhibitory effects of four alkaloids with chlorhexidine on metabolic activity of S. mutans planktonic cells

图4 4种生物碱与洗必泰对变形链球菌浮游细胞代谢活性的零相互作用效能模型Fig.4 Zero Interaction Potency model of four alkaloids with chlorhexidine on metabolic activity of S. mutans planktonic cells

2.4 4种生物碱与洗必泰对变形链球菌的生物被膜形成的协同抑制作用

和对浮游细菌代谢活性的协同抑制作用相似，这4种生物碱与洗必泰对变形链球菌生物被膜的形成也具有不同程度的协同抑制作用。具体来说，在浓度为1 μg/mL时，洗必泰只能抑制约10%的生物被膜形成，但是与10 mg/mL的苦参碱或20 mg/mL的氧化苦参碱联合使用时，可以达到约80%的抑制作用。2 μg/mL的洗必泰与5 mg/mL的槐果碱或10 mg/mL的槐定碱联合使用时，对生物被膜形成的抑制作用从20%增加到70% ～ 80%，见图5。通过零相互作用效能模型我们发现它们对变形链球菌生物被膜形成的协同抑制作用强弱依次为：苦参碱（平均协同得分18）>氧化苦参碱（平均协同得分12.8）>槐果碱 （平均协同得分0.8） >槐定碱（平均协同得分0.5），见图6。

图5 4种生物碱与洗必泰对变形链球菌生物被膜形成的协同抑制作用Fig.5 Synergistic inhibitory effects of four alkaloids with chlorhexidine on biofilm formation of S. mutans

图6 4种生物碱与洗必泰对变形链球菌生物被膜形成的零相互作用效能模型Fig.6 Zero Interaction Potency model of four alkaloids with chlorhexidine on biofilm formation of S. mutans

3 讨论

研究显示，细菌不仅能够以浮游状态存在，而且还存在于生物被膜中。生物被膜由胞外多糖，eDNA和多种蛋白质构成，对抗菌药物起到了扩散屏障的作用，被认为是细菌的一种强大防御机制[8-9]。苦参中的4种主要生物碱对变形链球菌浮游细胞的代谢活性以及生物被膜的形成都具有一定的抑制作用，其中氧化苦参碱的抑制作用弱于其它3种生物碱。由于浮游状态的细菌比生物被膜中的细菌更容易受到抗菌药物的影响，因此抑制变形链球菌生物被膜的生长比浮游细菌更加困难[10]。在这4种生物碱中，除了槐果碱以外，其它3种生物碱对生物被膜的抑制浓度都高于浮游细菌。

将天然药物与传统抗菌药物联合使用是防龋药物开发的另一条途径。在本研究中，苦参中的4种主要生物碱能够与洗必泰对变形链球菌浮游细胞的代谢活性表现出不同程度的协同抑制作用。亚抑制浓度的苦参碱能够使洗必泰对变形链球菌浮游细胞代谢活性的有效抑制浓度降低两个梯度（从2 μg/mL降低到0.5 μg/mL），而亚抑制浓度的氧化苦参碱、槐果碱和槐定碱使洗必泰的有效抑制浓度降低一个梯度（降低到1 μg/mL）。对变形链球菌生物被膜形成的协同抑制作用也有类似的趋势，亚抑制浓度的苦参碱和氧化苦参碱使洗必泰的有效抑制浓度降低两个梯度（从4 μg/mL降低到1 μg/mL），亚抑制的槐果碱和槐定碱协同作用稍弱，能够使洗必泰的有效浓度降到1个梯度（降低到2 μg/mL）。苦参中4种生物碱与洗必泰的联合用药能够在保持较高抑制活性的同时还降低洗必泰的使用浓度，从而在一定程度上减小了不良反应发生的风险。

用于协同研究的零相互作用效能模型进一步比较了这4种生物碱与洗必泰的协同抑制作用强弱，综合来看，苦参碱是4种生物碱中与洗必泰协同作用最强的药物，对浮游细胞的代谢活性以及生物被膜的形成都表现出了最强的协同活性。值得注意的是，氧化苦参碱在单独用药时与其它三种生物碱相比抑制作用较弱，与洗必泰对浮游细胞代谢活性的协同作用也比较差，但是对生物被膜的形成却有很强的协同活性。

4 结论

苦参中的4种生物碱可以在降低洗必泰使用浓度的情况下，与洗必泰对变形链球菌浮游细胞代谢活性以及生物被膜的形成表现出不同程度的协同作用。本研究为苦参中的生物碱与洗必泰联合使用以预防龋齿的新方法提供了一种思路。