五味子多糖的分离纯化及其抗糖尿病研究进展

吴 伦，高 悦，李 静，任文晨，苏 阳*

（1. 黑龙江中医药大学 中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江哈尔滨 150040）

五 味 子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill为 木兰科植物五味子的干燥成熟果实，最早记录于《神农本草经》，作为上乘药物已有2 000多年的药用历史，具有多种药用功效[1-2]。以往研究中学界普遍认为木脂素类成分是其主要药效物质，但随着各学科交叉加速融合，发现五味子中多糖成分亦有很强的生物活性[3]。《唐本草》中记载五味子补益五脏，系治疗糖尿病之上品，现代研究已证实五味子多糖能够起到抗糖尿病作用，并受到学界的广泛关注[3]。中药多糖制备过程复杂，因此多糖的制备自然也就成了药效物质基础及生物活性研究的重中之重。多糖提取和纯化方法多样，不同方法分离得到的五味子多糖各具差异，采取行之有效的分析手段是阐明多糖理化性质对生物活性影响的关键[4]。通过查阅相关文献，概述五味子多糖的提取、分离纯化、成分分析及抗糖尿病相关作用机制研究进展，为五味子多糖防治糖尿病药物的开发及五味子制品的临床合理应用提供借鉴。

1 五味子多糖研究进展

1.1 五味子多糖的提取

提取工艺是影响中药多糖种类和特性的因素之一。现阶段，最广泛的多糖提取方法是溶剂浸提法，但某些多糖溶解性复杂，常规提取方法不但耗时长，而且提取效率较低[5]。因此，学者们专注于提取多糖新技术的开发，例如，超声提取法、超声波辅助酶提取法、超声波-微波协同提取法等，多种方法各具优势，结果见表1。合适的提取方法不仅是增加提取率的手段，还有助于提高所得多糖提取物的生物活性。例如，超声波处理提取可以显著影响和改善五味子多糖的抗氧化活性，这可能与超声波降解有关，超声波提取将高分子量的多糖分解为适当的片段，降低其对氢键的影响，并提高羟基自由基的清除率[6]。两相萃取法在聚乙二醇6000（PEG 6000）-K2HPO4溶液系统中提取效率是传统方法的6倍，可能由于水相能够抑制杂质蛋白的溶解，而有机相有效提高五味子多糖的稳定性[7]。随着更多的五味子多糖结构与生物活性相互影响研究的出现，提取工艺对多糖的影响不容忽视，研究多糖在各提取过程中结构性变化对探究生物活性具有深远意义。

表1 五味子多糖提取方法Tab. 1 Schisandra chinensis polysaccharine extraction method

1.2 五味子多糖的纯化与分离

1.2.1五味子粗多糖制备 五味子多糖粗提物是一种包含蛋白质、色素、小分子和其它杂质的混合物，杂质纯化是多糖精制过程中不可忽视的步骤。现阶段研究中，汪艳群[14]分别将不同的除蛋白质方法应用到五味子多糖研究中，结果表明酶法联合三氯乙酸-正丁醇除蛋白效果最好，但在后续研究中，Sevag法因其操作简便且时间短等优势更多用于去除五味子粗多糖中的蛋白[15]。除此之外，为了获得更好的去除率，还可以将几种方法组合在一起以减少时间和溶剂用量，这还需要后续的研究进一步加以优化。五味子多糖中的色素总是影响多糖的纯化和性质分析，除色素时，活性炭法会吸收多糖，导致产量下降，过氧化氢处理也会使多糖部分水解，通常状况下，这两种方法很少用于脱色，所以目前大多采用聚酰胺柱层析或者阴阳离子交换树脂法对五味子多糖进行分离和色素的脱除[16-17]，其中聚酰胺DEAE-纤维素脱色法较为常用。同时，因为多糖大分子特性，使用膜透析法可以轻松除去小分子物质，如：寡糖和无机盐[18]。

1.2.2五味子多糖分离纯化 多糖大多数纯化方法都是基于溶解度差异，而分级沉淀技术被认为是一种独特且方便的方法，可选择性地得到在低级醇或酮中溶解度差异较大的多糖[19]。祁玉丽等[20]从五味子多糖中分离纯化出了三种多糖子级分，WSP-30、WSP-60、WSP-80是通过使用乙醇（30%、60%、80%）的梯度浓度分级沉淀而获得。另一方面，色谱技术是中药多糖最有效的分离和分析方法之一，其中纯化多糖最常用的方法是离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法，阴阳离子交换色谱常用填料为二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-Cellulose），而凝胶色谱常用填料有葡聚糖凝胶（Sephadex G）、聚丙烯酰胺葡萄糖凝胶（Sephacryl HR）和琼脂糖凝胶（Sepharose）等，针对五味子多糖纯化研究，两者一般配合使用，以期得到纯度更高的均一多糖，多糖纯化工艺总结，见表2。

表2 五味子多糖分离纯化方法Tab. 2 The method of separation and purification of Schisandra chinensis polysaccharides

1.3 五味子多糖的结构特征、理化特性及生物活性

多糖的活性通常取决于其分子结构和理化特性，包括分子量和单糖组成等[29]。目前，色谱法已广泛应用于多糖的组成和结构分析[30]，五味子多糖中单糖成分可以通过高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱（GC-MS）、气相色谱（GC）等分析鉴定，其分子量可以通过高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）和多角度激光散射（MALLS）等确定分析，因此针对现阶段五味子多糖提取分离情况进行总结，见表3。对于多糖均一化成分的提取、检验、分析促进五味子多糖研究的长远发展，为进一步阐明多糖结构影响活性奠定基础。

表3 五味子中多糖类成分Tab. 3 Polysaccharine ingredients in Schisandra chinensis

2 五味子多糖抗糖尿病作用相关机制

2.1 降低氧化应激水平

目前为止，糖尿病的发病机制尚不明确，但其发生过程中常伴随着内环境代谢紊乱，其中氧化应激水平的提高与糖尿病密切相关。NIU J M等[22]分离出一种水溶性五味子均一多糖（SSPW1），并对其在2型糖尿病大鼠体内的抗氧化和抗糖尿病作用进行了研究，结果表明，SSPW1通过增加糖尿病大鼠体内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性并降低肝脏组织中的丙二醛（MDA）水平起到降血糖作用。

2.2 调节葡萄糖转运体表达

葡萄糖转运体（GLUT-4）在葡萄糖的摄取和转运中起着至关重要的作用。JIN D等[44]使用BRL细胞建立胰岛素抵抗模型研究低重量分子多糖SCPP11的降血糖机制。结果表明，SCPP11通过上调胰岛素和5ʹ-单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）信号通路（例如胰岛素）中关键酶的mRNA水平来调节GLUT-4 mRNA和蛋白表达，例如：受体底物1（IRS-1）、磷酸肌醇3激酶（PL3K）和蛋白激酶B（Akt）。此外，SCPP11通过调节AMPKα和过氧化物酶体增殖物激活的受体γ（PPAR-γ）mRNA水平并减轻胰岛素抵抗改善葡萄糖消耗。

2.3 抑制JNK通路及保护胰岛β细胞

糖尿病模型胰岛β细胞凋亡是破坏胰岛功能的主要形式，因此，五味子多糖治疗糖尿病的关键是抑制胰岛β细胞凋亡并改善其功能，维持体内胰岛素分泌水平。陶雪[4]观察了五味子中酸性多糖对STZ诱导的T1DM和T2DM小鼠的作用，结果显示，五味子酸性多糖能显著降低T1DM和T2DM小鼠血清中FBG和MDA水平，提高FINS和SOD含量，并改善小鼠胰腺组织病理变化；同时抑制两种小鼠胰腺组织中P-JNK、BAX及Cleaved Caspase-3蛋白表达，促进Bcl-2蛋白释放，对H2O2诱导MIN6细胞损伤具有一定的保护作用，推测五味子酸性多糖降血糖作用可能与抑制JNK信号通路从而降低胰岛β细胞凋亡有关。

2.4 调节糖代谢及胰岛素抵抗

脂联素和抵抗素分别是由脂肪细胞分泌的胶原样血浆蛋白和多肽类激素，两者皆参与调节糖代谢和胰岛素抵抗治疗糖尿病。马育轩等[45]将粗制五味子多糖应用于高脂饮食联合STZ诱导的糖尿病大鼠模型。研究结果表明五味子粗多糖对大鼠血清中的脂联素水平有促进作用，同时降低抵抗素含量，减轻大鼠糖尿病样作用。

2.5 改善脂代谢

糖尿病患者通常伴有不同程度的脂代谢紊乱，研究表明，胰岛素抵抗是糖尿病与高脂血症的主要病因，所以调节机体脂质代谢可以促进糖尿病的治疗进程。王会堂等[46]对五味子多糖粗提物的降血脂功能进行研究。结果表明多糖组可明显升高HDL-C含量，同时降低TC、TG和LDL-C含量。表明多糖能有效改善脂代谢紊乱，降低血脂水平。赵婷[47]通过实验研究进一步表明多糖能够促进肝糖原合成并抑制其分解从而降血糖，同时能够显著改善脂代谢异常。

2.6 抑制炎症反应

随着糖尿病研究的不断深入，发现炎症反应已经成为胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能减退的主要原因之一，因此，改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞，抑制炎症反应发挥降低血糖作用是其关键作用机制。杜兴旭等[48]观察了五味子粗多糖对高脂饮食联合STZ诱导2型糖尿病大鼠血清中炎症因子的影响，并进一步探讨其治疗糖尿病的可能机制。结果表明，五味子粗多糖组大鼠FBG水平呈剂量依赖性降低，血糖AUC明显下降，INS水平和ISI明显升高，血清中IL-6、CRP、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均降低显著，说明可降低T2DM大鼠FBG水平，升高INS水平，改善五味子粗多糖胰岛素抵抗，其作用机制可能与抑制体内炎症反应相关。

2.7 其它

GAO X X等[27]发现一种五味子水溶性酸多糖SCP-BⅡ可改善四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的体重下降、多饮和高血糖症。陶雪等[49]探究了五味子多糖对2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用，研究表明，五味子粗多糖能显著降低2型糖尿病大鼠FBG、ALT和AST水平，提高INS含量，同时，五味子粗多糖能够降低肝组织中MDA水平，改善SOD活性，肝脏细胞脂肪变性减轻，起到改善2型糖尿病大鼠肝功能作用。

3 结论

本文概述了五味子多糖的提取、分离纯化、成分分析及其抗糖尿病相关作用机制，提取工艺选择和分离纯化工艺优化，成为五味子多糖开发使用的前提，同时也是分析生物活性的必备条件。