天然冰片对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤的保护作用

2021-07-24孙志军张俊婷张群林

现代中药研究与实践 2021年3期

孙志军，吴丹，张俊婷，郑琴，张群林*

（1. 安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032；2. 江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌 330004）

冰片包括天然冰片和合成冰片，天然冰片由樟科植物樟Cinnamomum camphora(L.) presl的新鲜枝、叶经提取加工制成。冰片在古籍中多以“龙脑香”“龙脑”为正名。宋代《本草衍义》记载：“此物大通，利关膈热塞，其清香为百药之先”。明代《本草纲目》记载：“龙脑香，释名片香、羯婆罗香。辛、苦，微寒，无毒。疗脑痛，通诸窍，散郁火”。研究表明冰片可通过镇痛[1]、抗炎[2]、抗氧化[3]和抗癫痫[4]等机制发挥神经保护作用，从而改善局灶性脑缺血[5]、阿尔茨海默症[6]等神经系统疾病导致的神经功能损伤。PC12细胞是一种可显示多种神经元特性的神经细胞株，已被广泛应用于神经系统疾病的体外研究[7-9]。6-OHDA是一种常见的用于实验模拟黑质变性的神经毒素[10]。本实验将建立6-OHDA诱导的PC12细胞损伤模型，用于研究天然冰片是否对PC12细胞具有保护作用，分别利用MTT法、倒置显微镜和流式细胞仪来检测细胞存活率、观察细胞形态以及检测细胞凋亡情况。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器

天然冰片（批号：20170112）购于吉安市聚鹏天然香料油有限公司；6-OHDA（批号：18834）购于美国MCE生物科技公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购于上海贝博生物科技有限公司；DMEM高糖培养基购于上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清、青霉素-链霉素溶液（100 ×）、胰酶购于中国碧云天生物有限公司；噻唑蓝（MTT）购于西格玛奥德里奇贸易有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购于国药化学试剂有限公司；TH4-200型倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；FACSVerse型流式细胞仪（美国碧迪公司）；Synergy HTX型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1天然冰片溶液的配制精密称取天然冰片粉末适量，用DMSO溶解配成浓度为200 mg/mL的储备液，4°C保存，使用时用细胞培养液稀释至所需浓度。

1.2.2细胞培养 PC12细胞培养于含10%胎牛血清中，青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL的DMEM高糖培养液，37℃，5% CO2。取对数生长期细胞传代，用胰酶消化，倒置显微镜下观察，计数并进行后续实验。

1.2.3天然冰片对正常PC12细胞毒性实验将PC12细胞分为对照组和天然冰片浓度分别为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的实验组。首先，将PC12细胞接种到96孔板中培养24 h。然后，对照组加入100 μL细胞培养液；实验组加入100 μL不同浓度的天然冰片溶液。每个浓度设置4个复孔，置培养箱中培养48 h后弃去孔内培养液，用PBS冲洗3次。接着，在每孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h后弃去孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO溶液。最后，将96孔板置于37℃摇床上震荡10 min至颗粒充分溶解，在酶标仪上测定490 nm处的吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.4细胞存活率实验将PC12细胞分为对照组、模型组和天然冰片浓度分别为7.5、15、30、60、120 μg/mL的实验组。首先，将PC12细胞接种到96孔板中培养24 h。然后，对照组加入100 μL细胞培养液；模型组加入100 μL 100 μmol/L的6-OHDA溶液；实验组提前24 h加入100 μL不同浓度天然冰片溶液培养，培养24 h后弃去孔内天然冰片溶液，PBS冲洗3次，加入100 μL 100 μmol/L的6-OHDA溶液。6-OHDA作用24 h后用MTT法检测细胞存活率。（MTT实验方法同“1.2.3”）

1.2.5细胞形态学实验将PC12细胞分为对照组、模型组和天然冰片浓度分别为7.5、15、30 μg/mL的实验组。首先，将PC12细胞接种到6孔板中培养24 h；然后，对照组加入2 mL细胞培养液；模型组加入2 mL 100 μmol/L的6-OHDA溶液；实验组提前24 h加入2 mL不同浓度天然冰片溶液培养，培养24 h后弃去孔内天然冰片溶液，PBS冲洗3次，加入2 mL 100 μmol/L的6-OHDA溶液。6-OHDA作用24 h后置倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.6细胞凋亡率实验 PC12细胞分组及给药方法同“1.2.5”。按照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明，胰酶消化并收集各组细胞于15 mL离心管中，在4℃、1 500 r/min条件下离心5 min，弃上清；用PBS冲洗2次后再次离心5 min，弃上清，收集细胞，用400 μL Annexin V结合液重悬细胞，转至流式管中，在细胞悬液中加入Annexin V-FITC染色液5 μL，轻轻混匀后，置于冰上避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液，轻轻混匀后于冰上避光孵育5 min后即可用流式细胞仪检测，检测波长为488 nm。

1.2.7统计学方法用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料用均数 ± 标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 天然冰片对正常PC12细胞毒性实验结果

实验结果显示，天然冰片浓度在0 ～ 200 μg/mL范围内时，PC12细胞存活率大于85%；当天然冰片浓度低于140 μg/mL时，PC12细胞存活率高于对照组细胞存活率，差异具有统计学意义（P＜0.01），说明该浓度范围的天然冰片对正常PC12细胞具有增殖作用；当天然冰片浓度高于160 μg/mL时，PC12细胞存活率低于对照组细胞存活率，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明该浓度范围的天然冰片对正常PC12细胞有一定的毒性作用，结果见表1。

表1 天然冰片对正常PC12细胞存活率的影响（±s, n = 6）Tab. 1 Effect of natural borneol on the cell viability of normal PC12 cells（±s, n = 6）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别细胞存活率/%对照组 100.0 ± 0.5天然冰片组（20 μg/mL） 158.2 ± 2.6**天然冰片组（40 μg/mL） 156.3 ± 2.1**天然冰片组（60 μg/mL） 152.1 ± 1.4**天然冰片组（80 μg/mL） 149.6 ± 0.6**天然冰片组（100 μg/mL） 146.2 ± 1.1**天然冰片组（120 μg/mL） 117.4 ± 1.0**天然冰片组（140 μg/mL） 112.6 ± 2.3**天然冰片组（160 μg/mL） 97.6 ± 1.5*天然冰片组（180 μg/mL） 94.3 ± 2.1*天然冰片组（200 μg/mL） 86.3 ± 1.5**F 1 447.318 P 0.000

2.2 天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞存活率的影响

实验结果显示，对照组细胞存活率为（100 ±1.2）%，模型组细胞存活率为（71.5 ± 2.3）%，模型组细胞存活率低于对照组细胞存活率，差异具有统计学意义（P＜0.01），该结果表明6-OHDA对PC12细胞具有损伤作用，提示建模成功；实验组细胞存活率高于模型组细胞存活率，差异具有统计学意义（P＜0.05），天然冰片浓度为15 μg/mL时，PC12细胞存活率最高，为（96.7 ± 2.6）%，结果见表2。以上结果表明，天然冰片可提高6-OHDA诱导损伤的PC12细胞的存活率。

表2 天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞存活率的影响（±s, n = 6）Tab. 2 Effect of natural borneol on the cell viability of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比，#P＜0.05，##P＜0.01

组别细胞存活率/%对照组 100.0 ± 1.2模型组 71.5 ± 2.3**天然冰片组（7.5 μg/mL） 83.5 ± 1.9##天然冰片组（15 μg/mL） 96.7 ± 2.6##天然冰片组（30 μg/mL） 87.4 ± 3.9##天然冰片组（60 μg/mL） 80.7 ± 4.5##天然冰片组（120 μg/mL） 77.6 ± 5.1#F 47.167 P 0.000

2.3 天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞形态学的影响

倒置显微镜下观察各组细胞形态，可见对照组PC12细胞呈梭形，胞体饱满，密度大，折光性较强（图1A）；与对照组相比，模型组PC12细胞体型变小，部分细胞损伤成圆形，密度减小，折光性减弱（图1B）；与模型组相比，实验组PC12细胞体型变大，密度增大，折光性增强，天然冰片浓度为15 μg/mL时效果最好（图1C、D、E）。以上结果表明，天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞有形态保护作用。

图1 天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞形态学的影响Fig.1 Effect of natural borneol on the cell morphology of PC12 cells injured by 6-OHDA

2.4 天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞凋亡的影响

实验结果显示，6-OHDA主要诱导PC12细胞早期凋亡，见图2。对照组细胞凋亡率为（0.6 ± 0.02） %，模型组细胞凋亡率为（28.7 ± 0.6）%，模型组细胞凋亡率高于对照组细胞凋亡率，差异具有统计学意义（P＜0.01），该结果表明6-OHDA对PC12细胞具有损伤作用，提示建模成功。实验组细胞凋亡率低于模型组细胞凋亡率，差异具有统计学意义（P＜0.01），天然冰片浓度为15 μg/mL时，PC12细胞凋亡率最低，为（7.3 ± 0.4）%，结果见表3。以上结果表明，天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞凋亡有抑制作用。

图2 天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞凋亡的影响（±s, n = 6）Fig.2 Effect of natural borneol on the apoptosis of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

表3 天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞凋亡率的影响（±s, n = 6）Tab. 3 Effect of natural borneol on the apoptotic rate of PC12 cells injured by 6-OHDA （±s, n = 6）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别细胞凋亡率/%对照组 0.6 ± 0.02模型组 28.7 ± 0.6**天然冰片组（7.5 μg/mL） 20.4 ± 0.4##天然冰片组（15 μg/mL） 7.3 ± 0.4##天然冰片组（30 μg/mL） 11.7 ± 0.4##F 2 019.042 P 0.000

3 讨论

有文献报道芳香开窍药对神经细胞有很好的保护作用，苏合香挥发油可保护大鼠皮层神经细胞免受糖氧剥夺/再复氧（OGD/R）的损伤[11]；麝香可保护局灶性脑缺血大鼠神经元[12]。但这类中药大部分成分复杂，药效成分不明确，生物靶点多，这就导致其发挥神经保护作用的药效成分很难确定。天然冰片为小分子化合物，2020年版《中国药典》规定天然冰片含右旋龙脑不得少于96.0%，其具有药效成分单一、明确、纯度高的优点。本研究以6-OHDA诱导损伤的PC12细胞为实验对象，对天然冰片的神经保护作用进行了研究。结果显示，天然冰片可以保护PC12细胞免受神经毒素6-OHDA的损伤，但天然冰片保护PC12细胞的机制尚不明确。芳香开窍药石菖蒲的药效成分β-细辛醚可通过抑制TNF-α、IL-1β的分泌，下调水通道蛋白4（AQP4）的表达来保护星形胶质细胞，发挥神经保护作用[13]，天然冰片可能通过相似的机制发挥对PC12细胞的保护作用，课题组后期将对其机制进行研究。

有文献报道天然冰片可通过抑制脑海马体CA1、CA3区中瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）和瞬时感受器电位香草酸受体Ⅰ型蛋白（TRPV1）的表达以及增加神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的释放，对癫痫持续状态模型小鼠发挥抗惊厥作用[14]；天然冰片可通过增加B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）基因表达量，降低Bcl-2相关蛋白的表达来实现对阿尔兹海默症的治疗作用[6]。已有研究表明天然冰片对神经损伤有治疗作用。本研究不足之处在于未对天然冰片对6-OHDA诱导损伤的PC12细胞的治疗作用进行研究，后期将进行考察。