冰片衍生物对血脑屏障通透性影响的研究

陈传兵， 刘昌辉， 伍海涛， 张荣， 赵威， 李伟荣， 杨蕾， 宓穗卿， 王宁生

（广州中医药大学，广东广州 510405）

血脑屏障是多样而复杂的动态系统，它允许血液循环中脑组织所需的营养物质通过，有效地阻挡有害物质的侵入，又能将代谢产物排出，并根据脑内成分的各种需要作出反应，从而维持脑环境的恒定，保证中枢神经系统的正常结构和功能。但血脑屏障同时也阻碍了药物进入大脑，导致药物难以透过血脑屏障达到脑内有效治疗浓度，从而给脑部疾病如脑肿瘤、中枢神经系统感染、药物成瘾性等疾病的治疗造成困难。冰片是一种常用中药，具有广泛的药理作用，如：镇痛抗炎[1]、抗菌[2]、抗血栓[3]等，最突出的是促进药物透过血脑屏障的作用[4-5]。在长期的临床用药中，冰片自身存在的弱点逐渐显露出来，如药效作用不强、刺激性大、挥发性强[6]，并存在一定毒副作用等[7]特点，这些成为了影响冰片临床应用的主要因素。为了降低冰片毒副作用，增强药效，课题组前期对冰片进行结构修饰，合成了多个未见文献报道的冰片衍生物[8-9]，并研究了冰片衍生物的镇痛作用[10]和对惊厥模型小鼠氨基酸类神经递质的影响[11]。本研究通过比较10种冰片衍生物与冰片在小鼠体内透血脑屏障效果，筛选药效作用较强、不易挥发，毒副作用较低的冰片衍生物，为开发新一代透血脑屏障药物提供实验依据，这对于拓展冰片的应用范围，对脑靶向给药系统的研究和脑部疾病的治疗具有较大的参考价值。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1动物清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量（18±5）g，由广东省卫生厅实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCKK粤2008-0002。适应性喂养3 d（温度20～25℃，湿度60%～70%）后，用于实验。给药前小鼠禁食过夜，自由饮水。

1.2药物与试剂2-氯苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、3-硝基苯甲酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯、对氯苯甲酸冰片酯、苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯（冰片衍生物均为本课题组自制，纯度大于98%）；5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），吐温-80，右旋冰片（含量97.5%，江西吉安林科天然冰片厂生产，使用前研粉，过100目筛备用）。医用酒精，生理盐水、丙酮、伊文思蓝（购自广州东巨化学试剂公司，均为分析纯）。

1.3仪器AUM2200电子分析天平（日本Shimadzu公司）；KDC-220HR高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；EnSpire多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）。

1.4药液配制精密称取0.4 g伊文思蓝转移入100 mL容量瓶中，加生理盐水定容至刻度线即得0.4%溶液（w/v）；丙酮和生理盐水混匀（7∶3）（v∶v）即得用于匀浆的混合液。各精密称取2-氯苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、3-硝基苯甲酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯、4-氯苯甲酸冰片酯0.5 g，研磨后各加5%CMC-Na助溶配成悬浮液（50 mg/mL）；各精密称取0.5 g苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯，研磨后加5%吐温-80助溶配成溶液（50 mg/mL）；精密称取0.5 g右旋冰片2份，一份研磨后加10 mL 5%CMC-Na助溶配成浓度为50 mg/mL的悬浮液，另一份研磨后加入10 mL 5%吐温-80助溶配成浓度为50 mg/mL的溶液。

1.5伊文思蓝标准曲线绘制用空白小鼠脑浆配制伊文思蓝倍释系列浓度溶液0、1、2、5、10、20、50μg/g，用酶标仪于630 nm波长处检测光密度，求得标准曲线。

1.6分组与给药方法根据药物的溶解性，采用2种溶剂作对照，即CMC-Na组和吐温-80组。其中：CMC-Na组包括5%CMC-Na溶剂组、右旋冰片（阳性对照）组、2-氯苯甲酸冰片酯组、4-氯苯甲甲酸冰片酯组、3-硝基苯甲酸冰片酯组、4-硝基苯甲酸冰片酯组、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯组，每组16只，雌雄各半；吐温-80组包括吐温-80溶剂组、右旋冰片组（阳性对照）、苯甲酸冰片酯组、3-甲基苯甲酸冰片酯组、4-甲基苯甲酸冰片酯组、三氯乙酸冰片酯组，每组16只，雌雄各半。

1.7透血脑屏障作用实验小鼠按体质量（0.02 mL/g）灌服给药60 min后，于尾静脉注射0.4%伊文思蓝溶液（10 mL/kg），2 min后断头取脑，脑组织用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称质量，按1∶8（w∶v）加入丙酮-生理盐水（7∶3）（v∶v）匀浆，匀浆液于70℃孵育0.5 h，以3 000 r/min离心15 min，取200μL上清液，用酶标仪于630 nm波长处检测其光密度。

1.8统计方法采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料结果以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1伊文思蓝的标准曲线见图1。酶标仪法：y=0.010 5x+0.050 3，R2=0.999 6。结果表明线性关系良好，符合生物样品测定要求。

2.2酶标仪法测定冰片衍生物开放血脑屏障作用实验结果用CMC-Na作助溶剂的冰片衍生物中，2-氯苯甲酸冰片酯组血脑屏障通透性效果显著优于右旋冰片组（阳性对照），差异有统计学意义（P<0.001）；4-硝基苯甲酸冰片酯和1-萘乙酸冰片酯组效果与右旋冰片组相当，差异无统计学意义（P>0.05）；而4-硝基苯甲酸冰片酯组、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯组、1-萘乙酸冰片酯的效果显著低于右旋冰片组。具体结果见表1。

图1 伊文思蓝标准曲线（酶标仪法）Figure 1 Evens blue standard curve（enzyme-labeled instrument method）

表1 用CMC-Na作助溶剂的冰片衍生物对小鼠血脑屏障通透性的影响Table 1 Effect of borneolderivatives dissolved in CMC-Na on blood-brain-barrier permeability in mice （x±s）

用吐温-80作助溶剂的冰片衍生物中，各药物组与右旋冰片组（阳性对照）相比，效果相当，无显著性差异（P>0.05），具体结果见表2。

表2 用吐温-80作助溶剂的冰片衍生物对小鼠血脑屏障通透性的影响Table 2 Effect of borneolderivatives dissolved in Tween-80 on blood-brain-barrier permeability in mice （x±s）

3 讨论

本实验结果表明：在10种冰片衍生物中，只有2-氯苯甲酸冰片酯的血脑屏障通透性优于右旋冰片；苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯和萘乙酸冰片酯效果与右旋冰片相当；3-硝基苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯和4-氯苯甲酸冰片酯效果低于右旋冰片。2-氯苯甲酸冰片酯的血脑屏障通透性显著优于右旋冰片，因此，其有望开发成为新一代透血脑屏障的药物。