柚皮苷对亚硝酸钠致记忆障碍模型小鼠的改善作用

2021-07-24佟玉良赵德萍肖洪彬1

现代中药研究与实践 2021年3期

雷霞，佟玉良，赵德萍，崔悦，张宁,3*，肖洪彬1,*

(1.黑龙江中医药大学博士后流动站，黑龙江哈尔滨150040；2. 黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150040；3. 黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江佳木斯 154007；4. 佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007)

随着全球老龄化社会的到来，阿尔兹海默症（AD）将成为影响人类生存质量的重要疾病。大量研究结果表明海马体淀粉样蛋白（Aβ）异常沉积、Tau过度磷酸化是AD典型的病理特征[1]，但是AD的发病原因和具体机制目前尚不明晰。老年女性的痴呆发病率是老年男性的2倍，与更年期相关的雌激素降低可能是一个重要诱因。基于临床样本的研究也显示了迟发性AD风险存在性别差异[2]。适当的雌激素替代疗法不仅可以改善AD患者的认知功能，还能有效预防AD的发生。植物雌激素能够选择性地与脑雌激素受体β（ERβ）结合，对雌激素受体α（ERα）的选择性较低，因此，在展现出良好的神经元保护作用的同时，不会引起雌二醇类似的副作用[3]。

柚皮苷是一种来源广泛的植物雌激素，在橘科植物的皮或中药材中都有大量的分布[4-5]。柚皮苷对多种痴呆动物模型的认知功能都有显著的改善作用[6]。本实验将对柚皮苷改善学习记忆的机制进行深入研究，验证柚皮苷是否通过ER-P38/MAPK信号，调节Aβ代谢，对海马体神经元产生保护作用，为证明柚皮苷抗AD的有效性提供依据，为开发植物雌激素抗AD的研究提供基础。

1 材料

1.1 实验动物

昆明小鼠75只，8月龄，雄性，清洁级，体质量为（22 ± 2）g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号：SCXK（辽）2018-0001。正常饲料，自由进水进食。实验流程均符合黑龙江中医药大学实验动物管理委员会的要求，并通过实验动物伦理委员会的批准。

1.2 药物与试剂

柚皮苷（北京百灵威科技有限公司，L750N46）；亚硝酸钠（天津科密欧，01-25-12）；盐酸多奈哌齐（源叶生物，S60449）；ICI182780（TOCRIS）购于安诺伦生物；Anti-ERβ（bs-0116R）、Anti-pp38MAPK抗体（bs-2210R）、兔抗β-actin多克隆抗体（bs-0061R）、HRP标记羊抗兔IgG（bs-0295GHRP）、兔抗 Anti-APPBP1（bs-12503R）等购于北京博奥森；BACE 1（5606T）、兔抗ERα多克隆抗体（Cell Signaling，644T）、预染Marker（P0069）等购于美国CST公司。

1.3 实验仪器

ZH-Morris型水迷宫程序自动控制仪（正华生物仪器设备有限公司）；MiniPROTEANTetra Cell型电泳仪（BIO-RAD公司）；HT7700型透射电镜（日立仪器有限公司）；Trans-Blot SD Cell型半干转膜仪（BIO-RAD公司）；SmartChemi500型化学发光成像仪（北京赛智创业）。

2 方法

2.1 分组及给药

75只小鼠随机分为5组，空白组（Control）、模型组（Model）、阳性药组（Positive）、柚皮苷组（Naringin）、柚皮苷+ER阻断剂（NG +ICI182780）组。Control组及Model组灌胃给予蒸馏水；Positive组、Naringin组灌胃分别给予雌二醇（20 mg/kg·d）及柚皮苷（100 mg/kg·d），NG +ICI182780组先腹腔注射ICI182780 （0.072 mg/kg·d），15 min后给予柚皮苷。

2.2 造模

第22天除空白组腹腔注射生理盐水外，其余组连续7 d腹腔注射等量的亚硝酸钠，每日100 mg/kg，第29天开始，每日给药后30 min进行行为学试验。

2.3 行为学检测

采用新物体识别实验、Morris水迷宫定位航行实验及空间探索实验观察小鼠认知能力。识别指数=（Tn-Tf）/（Tn+Tf）。记录动物对新物体的接触时间为（Time new，Tn）和对旧物体的接触时间（Time familiar，Tf）。

2.4 取材

行为学测试后当天下午取材，小鼠采用1%戊巴比妥钠（0.01 mL/g）腹腔注射实施麻醉，小鼠进入麻醉外科期深度时快速断头，取出鼠脑组织中海马体及下丘脑，病理学方法检测海马体及下丘脑形态和ER受体的表达。取出的海马体及下丘脑常规方法进行石蜡包埋，切片，HE染色。透射电镜固定，脱水、浸透、包埋及切片后，电镜下观察小鼠海马体超微结构变化并拍摄。采用Motic Med 7.0数码医学图像分析系统计算。另一半海马体液氮速冻后蛋白提取，蛋白浓度测定按照BCA试剂盒说明书操作，计算各组样品的蛋白浓度，蛋白印迹法观察蛋白质变化。

3 结果

3.1 行为学测试结果

新物体识别实验测试结果如图1所示，新物体识别试验中，与Control相比，Model组小鼠识别指数减小，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Model组相比，Positive和Naringin组小鼠识别指数增加，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Naringin组相比，NG + ICI182780组小鼠识别指数减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）。

图1 柚皮苷对小鼠新物体识别指数的影响（n = 15）Fig.1 Effects of naringin on new object recognition experiment in mice（n = 15）

小鼠在前4 d训练中寻找平台潜伏期时长逐渐降低，但Control组、Naringin组小鼠潜伏期下降较快。结果如图2所示，与Control组相比，Model组小鼠定位航行实验潜伏期增加，差异具有统计学意义（P<0.01），表明小鼠记忆巩固能力较差。与Model组相比，Positive组和Naringin组小鼠潜伏期减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Naringin组相比，NG + ICI182780组小鼠潜伏期减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）。NG + ICI182780组小鼠搜台潜伏期明显高于柚皮苷组，说明在ER阻断剂的干预下，小鼠学习进步缓慢。

图2 柚皮苷对小鼠定位航行潜伏期的影响（n = 15）Fig.2 Effects of naringin on navigation latency of mice（n = 15）

空间探索试验结果如图3所示，与Control组相比，Model组小鼠平台穿越次数和目标象限停留时间减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Model组相比，Positive组和Naringin组小鼠平台穿越次数和靶象限停留时间增加，差异具有统计学意义（P<0.01）；与Naringin组相比，NG+ICI182780组小鼠平台穿越次数和靶象限停留时间降低，差异具有统计学意义（P< 0.01），靶象限停留时间降低，差异具有统计学意义（P< 0.05）。

图3 柚皮苷对小鼠空间探索试验的影响（n = 15）Fig.3 Effects of naringin on spatial exploration of mice（n = 15）

3.2 柚皮苷对亚硝酸钠模型小鼠海马区及下丘脑区组织病理改变的影响

Control组小鼠的海马区神经细胞排列整齐，数量较多，染色均一。亚硝酸钠损伤了小鼠海马区，表现为紊乱排列和缩小的神经元细胞，由于核固缩现象明显，见不到明显的核仁；无论Positive组还是Naringin给药组都在一定程度上恢复了海马区神经元的数量，形态正常，排列规整，核仁清晰，见图4。下丘脑的HE染色显示亚硝酸钠损伤了小鼠下丘脑，神经细胞排列松散, 细胞间隙较宽，细胞核未着色，细胞核体积明显扩张，核仁不明显，部分细胞结构消失，Positive组也出现了与Model组相类似的病理变化；Naringin给药组神经元细胞排列较为紧密，细胞间隙适中，细胞核深染，核仁清晰。ICI182780的干预使Naringin对海马区和下丘脑区的神经元的保护作用大大减弱，见图5。

图4 小鼠海马体区神经细胞病理形态（HE染色，×200）Fig.4 Neuropathological morphology of hippocampus in mice（HE staining, ×200）

图5 小鼠下丘脑区神经细胞病理形态（HE染色，×200）Fig.5 Pathological morphology of neurons in the hypothalamus of mice（HE staining, ×200）

3.3 透射电镜观察小鼠海马体超微结构

Model组和雌激素阻断剂组神经元镜下细胞核出现固缩状态，核膜增厚，线粒体絮状变性，粗面内质网扩张脱颗粒，突触膜结构不清晰，囊泡数量减少。Control组小鼠神经元核膜结构清晰，染色质如细沙状呈现，细胞核占据大部分视野，粗面内质网丰富，线粒体发达，突触膜结构完整，小泡数量较多。Positive组和Naringin组较相似，神经元细胞核膜结构清晰，胞质内粗面内质网轻度扩张，线粒体发达，囊泡数量明显增多，见图6。

图6 小鼠海马体区神经元细胞超微结构Fig.6 Ultrastructure of nerve cells in hippocampus of mice

3.4 免疫组织化学观察海马体ER表达

与Control组相比，Model组小鼠海马体中ERβ表达减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Model组相比，Naringin组小鼠ERβ表达增加，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Naringin组相比，NG + ICI182780组小鼠ERβ表达减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）。与Control组相比，Model组小鼠海马体内ERα表达情况减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Model组相比，给药组小鼠ERα表达增加，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Naringin组相比，雌激素阻断剂组小鼠ERα表达减少，差异具有统计学意义（P< 0.01），见图7。

图7 柚皮苷对小鼠海马体ERβ、下丘脑ERα表达的影响（OD值）Fig.7 Effects of Naringin on the expression of ERβ in hippocampus,ERα in hypothalamus of mice（OD Value）

3.5 海马体中 ERβ和P-P38/P38蛋白的变化

与Control组相比，Model组小鼠海马体ERβ蛋白表达减少，P-P38/P38蛋白表达增加，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Model组相比，给药组小鼠海马体ERβ蛋白表达增加，差异具有统计学意义（P< 0.01）；P-P38/P38蛋白表达减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Naringin组相比，NG +ICI182780组小鼠海马体ERβ蛋白表达减少（P<0.01）；P-P38/P38蛋白表达增加，差异具有统计学意义（P< 0.01），见图8。

图8 柚皮苷对小鼠海马体ERβ和P-P38/P38表达的影响（n = 3）Fig.8 Effects of naringin on the expression of ERβ and P-P38/P38 in hippocampus of mice（n = 3）

3.6 海马体中APP和BACE1蛋白的含量变化

与Control组相比，Model组APP、BACE1表达增加，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Model组相比，给药组APP、BACE1表达减少，差异具有统计学意义（P< 0.01）；与Naringin组相比，NG+ICI182780组小鼠海马体中APP、BACE1表达增加，差异具有统计学意义（P< 0.01），见图9。

图9 柚皮苷对小鼠海马体中APP、BACE1表达的影响（n = 3）Fig.9 Effects of Naringin on the expression of APP and BACE1 in hippocampus of mice（n = 3）

4 讨论

亚硝酸钠诱导的模型小鼠表现出认知能力的显著下降，与AD患者临床表现出的渐进性记忆巩固功能障碍相类似。本研究证明了柚皮苷能够明显改善记忆损伤小鼠的学习记忆障碍，与阳性对照药雌二醇有类似的作用，但却未出现对下丘脑明显的损伤作用。

众所周知，AD主要病理特征为海马体Aβ的异常沉积。BACE1是APP生成 Aβ 所需的限速酶。柚皮苷可降低APP、BACE1的表达，降低Aβ沉积概率，减轻海马区神经元细胞损伤，从而减轻模型小鼠痴呆表现。在雌激素受体阻断剂反向验证下，柚皮苷的保护作用明显减弱，说明柚皮苷对Aβ形成的有效抑制是依赖于ER的。

ERα 主要分布在下丘脑，亚硝酸钠模型小鼠脑源性雌激素快速消耗，雌激素分泌减少的同时，ERα表达下调。柚皮苷对下丘脑的病理无明显改变，表明柚皮苷在本文所用的剂量具有较高的选择性，对ERα也无明显的调节作用。ERβ 主要分布大脑皮质、海马体以及小脑等部位，精确参与调控与神经元存活密切相关的神经递质、酶或者结构蛋白等基因转录。本研究结果表明柚皮苷可通过上调ERβ受体发挥神经保护作用，并且能通过MAPK/P38信号途径发挥快速非基因调节效应，从而改善神经元的结构和功能。

柚皮苷拥有植物雌激所具有的杂环多酚结构，与ERβ具有较高的亲和力。从本文的研究结果分析，其具有雌激素样效应，对下丘脑ERα影响较小，可选择性作用于海马体ERβ受体。而且，与雌二醇相比柚皮苷对下丘脑的抑制作用较小，长期给药未出现下丘脑的明显萎缩。这一特征使其相较于经典雌激素（人工合成）具有一定的优势。本研究证明了柚皮苷能够上调模型小鼠ERβ表达，在ICI182780的反向验证下，同时证明了柚皮苷对P-P38/P38抑制作用是依赖于ER实现的。