宁夏民间药鸡娃草的质量标准研究

2021-07-24杨丽娟火明才康菊英卢海瑞

现代中药研究与实践 2021年3期

莫婷，何婷，徐静，杨丽娟，杨森，火明才，康菊英，卢海瑞，马力

（1. 宁夏回族医药研究所，宁夏银川750021； 2. 宁夏中医医院暨中医研究院，宁夏银川 750021）

鸡娃草为白花丹科鸡娃草属植物鸡娃草Plumbagella micrantha（Ledeb.） Spach的全草，又名小蓝雪花、刺矾松、蓝雪草等，是鸡娃草属唯一品种，与白花丹属亲缘关系最近[1]。鸡娃草在我国西北、西南地区分布广泛，生于海拔2 000 ～ 3 500 m的山坡和田间。在宁夏省六盘山、南华山地区主要生长在盐碱性地带[2]。有文献记载在俄罗斯西伯利亚阿尔泰边疆地区及乌克兰克里米亚半岛的南部海岸地区亦有分布[3-4]。长期以来，宁夏地区民间常用鸡娃草治疗湿疹、手廯、足廯、神经性皮炎等症[5]，该药材性寒，味苦，归肺经，具有解毒、止痒、杀虫的功效，鲜品外用治疗各种皮肤癣，以及疣痣、恶肉等病症具有奇特疗效[2]。但是，鸡娃草缺乏相应的质量控制标准，在历版《中国药典》及各地方标准中均未收载，且没有指标性成分用于该药材的鉴别与质量控制。

有报道发现鸡娃草中除了含有白花丹科常见的花色苷、山柰苷和槲皮苷等黄酮苷类化合物以外[6-7]；还含有以白花丹素（5-hydroxy-2-methyl-l,4-naphthoquinone, C11H8O3）为代表的α-萘醌类成分。药理学研究发现白花丹素具有显著的抗炎、抗菌活性，并对多种癌细胞增殖具有抑制作用[8-16]，与鸡娃草药材解毒、止痒、杀虫的功效接近，是鸡娃草的主要药效物质之一。因此，本研究在文献调研的基础上，首次选择白花丹素为鸡娃草的指标性成分，初步探索了鸡娃草药材的质量标准研究方法，包括性状、显微、薄层色谱鉴别及白花丹素成分的定量方法，为控制鸡娃草的药材质量和进一步开发利用及扩大药用资源提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）； DM3000型光学显微镜（德国徕卡公司）；ME204型万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；74-05332型鼓风干燥箱（德国宾德公司）；P/N560-01302-00型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；SX2-10-13型马弗炉（上海树立仪器仪表有限公司）；KQ-250DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；ZF-8型暗箱式紫外分析仪（上海勤科分析仪器有限公司）。

1.2 材料

白花丹素对照品（成都普瑞法生物科技开发有限公司，纯度 > 98%，批号：PRF8032121）；甲醇［色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；其它试剂均为分析纯，水为超纯水；硅胶板（青岛海洋化工厂分厂，G100×100mm）。鸡娃草药材分别采自宁夏固原市六盘山区、泾源县及隆德县等城区，经宁夏大学农学院李小伟副教授鉴定为白花丹科植物鸡娃草Plumbagella micrantha（Ledeb.） Spach的全草。

2 方法及结果

2.1 性状鉴别

本品为鸡娃草的干燥全草，根细长圆柱形，略微弯曲，较多分枝，表面红棕色或灰褐色，上端着生多数细根。茎直立或斜上，有条棱，沿棱有稀疏小皮刺，多分枝，绿色或紫红色，质轻，易折断，断面皮部纤维状，髓部类白色，海绵状，松软；叶片完整者展平后呈倒卵状披针形或披针形，多皱缩破碎，基部箭形或耳形而抱茎，先端渐尖，上面绿色或红紫色，下面灰绿色或淡红紫色；穗状花序顶生，等筒状；花粉红色或淡蓝紫色；气微；味淡。

2.2 显微鉴别

粉末特征：粉末呈棕绿色或红棕色。叶上表皮细胞多角形，垂周壁较平直；下表皮细胞类长方形，垂周壁微波状弯曲状；气孔不等式，副卫细胞2 ～ 3个。网纹导管、梯纹导管多见，环纹或螺纹导管少见，直径5 ～ 35 µm。木纤维成束，多亮黄色，壁薄或微木化，直径8 ～ 12 µm。韧皮纤维棕绿色，长梭形，顶端尖，壁增厚，直径10 ～ 20 µm。石细胞单个散在或成群，类方形、类长方形、多角形或纺锤形，黄绿色，直径20 ～ 50 µm，壁厚。分泌道内含红棕色分泌物，存在于植物根部。非腺毛具1 ～ 10余个细胞，多平直、顶端钝圆，少数顶端细胞皱缩扭曲。草酸钙簇晶散在，直径10 ～ 25 µm。花粉粒类圆形，直径20 ～ 30 µm，数目较多，表面光滑，具3 ～ 4个萌发孔。油细胞含黄色或红黄色油状物，类方形、类长方形或类圆形。分泌细胞成束，长条状，内含淡紫色或黄白色分泌物，直径8 ～ 10 µm。棕色块多数，红棕色，不规则，见图1。

2.3 薄层色谱TLC鉴别

按照薄层色谱法（《中国药典》2020版四部通则0502）试验，吸取供试品和对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（8∶1∶1）为展开系统，展开后取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，日光下显相同的浅黄色斑点，紫外灯254、302、365 nm下均显棕黄色斑点。薄层板置于氨水蒸气中熏至斑点变色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点，见图2。

图2 鸡娃草药材薄层色谱图Fig.2 TLC chromatograms of Plumbagella micrantha

2.4 水分、灰分和醇溶性浸出物测定

6批样品醇溶性浸出物测定、水分测定、灰分测定分别按《中国药典》2020版四部通则“2201浸出物测定法”项下冷浸法及醇溶性浸出物测定法、通则“0832水分测定法”项下烘干法、通则“2302灰分测定法”项下总灰分测定法及酸不溶性灰分测定法进行测定，结果见表1。

表1 6批鸡娃草各指标测定结果Tab.1 The measurement results of various indicators of 6 batches Plumbagella micrantha

2.5 白花丹素含量测定

2.5.1色谱条件按照高效液相色谱法（《中国药典》2020版四部通则0512），采用安捷伦Agilent 1260 ChemStation工作站；色谱柱为Phenomenex luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水溶液（70∶30）等度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测器为二极管阵列检测器，图3中供试品溶液和白花丹素对照品溶液的波峰均在268 nm附近，可选择作为检测波长；柱温：25℃；进样量：10 μL 。

2.5.2对照品溶液的制备精密称取白花丹素对照品0.002 9 mg 置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容至10 mL，精密量取1.0 mL该溶液至10 mL容量瓶中，甲醇定容至10 mL，摇匀，配制成每1.0 mL含29.0 μg的白花丹素对照品溶液。

2.5.3供试品溶液的制备鸡娃草全草药材粉末过2号筛，精密称定1.0 g置于100 mL具塞锥形瓶中，加入15 mL甲醇，超声提取30 min后取出，冷却后用甲醇补足质量，摇匀，滤过，取滤液过0.22 μm 滤膜，作为供试品溶液。

2.5.4系统适应性考察发现，按照“2.5.2”“2.5.3”项下方法进行配制，并在上述色谱条件下，白花丹素在9.4 min出峰，且峰形对称、尖锐。鸡娃草全草供试品色谱和白花丹素对照品色谱在相同的保留时间上有对应的吸收峰，与其它峰的分离度良好，且均在268 nm处有最大紫外吸收，表明系统适应性良好，见图3。

图3 白花丹素对照品及鸡娃草全草供试品色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of plumbagin and Plumbagella micrantha

2.5.5线性关系考察分别精密吸取白花丹素对照品溶液按“2.5.1”项下色谱条件依次进样1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μL，以峰面积为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=5 452.9X－7.809 8，R2= 0.999 9。结果表明，白花丹素在0.029 0 ～ 0.290 0 μg 进样量范围内呈良好的线性关系。

2.5.6精密度试验按“2.5.1”项下色谱条件重复进样白花丹素对照品溶液（0.029 0 mg/mL）6次，进样量为10 μL，测得峰面积，RSD 值为0.98%，表明仪器精密度良好。

2.5.7重复性试验取同一批次的鸡娃草全草药材粉末6份，按照“2.5.3”项下方法平行配制6份供试品溶液，并按“2.5.1”项下色谱条件进样10 μL，测定白花丹素的峰面积，RSD值为1.06%。

2.5.8稳定性试验取鸡娃草全草药材按照“2.5.3”项下方法配制，并按“2.5.1”项下色谱条件分别在制备后0、2、4、8、10、24 h进样测定，测定白花丹素峰面积的RSD值为0.73%，表明样品溶液避光放置在24 h内保持稳定。

2.5.9加样回收率试验取已知含有量的鸡娃草全草药材粉末样品（批号：20200915YBQ-2）约1.0 g，共9份，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，再精密称取白花丹素对照品0.007 9 g，按“2.5.2”项下制备成每1 mL含7.9 mg的对照品溶液，分别精密吸取该对照品溶液81、102和122 µL各三份于相应的锥形瓶中。按“2.5.3”项下制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，加样回收率平均值为99.82%，RSD为1.97%。

2.5.10样品测定取10批鸡娃草样品，精密称定，分别按上述条件制备供试品溶液和进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 鸡娃草不同采收批次含量测定结果Tab. 2 Determination results of different batches of Plumbagella micrantha

此外，从鸡娃草药材中选取绿色的根、茎、叶，以及随着季节变换，植物自然生长逐渐变为红色后的根、茎、叶，各3批，分别精密称取药材粉末，考察鸡娃草不同颜色不同药用部位中白花丹素的含量差异。按“2.5.1”和“2.5.3”项下方法进行测定，计算鸡娃草不同颜色不同部位中白花丹素的含量，结果见表3。

表3 鸡娃草不同颜色不同部位含量测定结果Tab. 3 Determination results of different medicinal parts and colors of Plumbagella micrantha

3 讨论

鸡娃草植物在宁夏分布较为广泛，多集中在固原市六盘山地区，野生资源丰富，但目前市售多为鸡娃草浸膏和提取物，无原药材售卖，因此本研究所用10 个批次的样品均为宁夏南部地区的野生鸡娃草药材，对其进行了性状及显微鉴别，发现药材性状特征基本一致，显微特征稳定，TLC鉴别结果显示分离度、斑点相对位置和重复性较好。此外，在不同波长的紫外灯下，还观察到其它多个不同颜色的清晰斑点，提示鸡娃草中的化学成分值得进一步研究。根据研究结果初步拟定：鸡娃草药材（宁夏地区）水分不得超过6.0%；总灰分不得超过15.0%；酸不溶性灰分不得超过8.0%；醇溶性浸出物不得少于2.0%。本研究还建立了鸡娃草药材中白花丹素的HPLC定量测定的方法，对10批鸡娃草药材全草进行了定量分析，结果表明各样品均可检出白花丹素，且含量有一定的差异。此外，考察发现鸡娃草药材根、茎、叶中白花丹素的含量差异较为显著，且随着季节变换，药材性状由绿色逐渐变为红色后，白花丹素在根、茎、叶中的含有量高低分布也随之变化，绿色药材根中的白花丹素含量最高，而红色药材叶中的白花丹素含量最高，这可能与其适应自然环境体内正常的产物分布和代谢有关。根据实验结果，综合药材的来源、采收季节及存放等原因，初步拟定鸡娃草药材全草白花丹素含量应不得少于0.07%。