一株诺卡氏菌的分离鉴定、药敏试验及治疗方案探讨

王友娟，徐 祥，尹怀磊，李 华，夏 伟，张 浩，冷敦鹏

(1.青岛中仁动物药品有限公司，山东 青岛 266329；2.胶州市农业农村局，山东 青岛 266329)

目前我国水产动物结节病的发生呈逐年上升趋势，对乌鳢(Snakehead)、卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)、罗非鱼(Tilapiamossambica)、高体(Serioladumerili)、鲈等经济鱼类造成巨大危害(范宁宁，2018)。其中引起乌鳢类结节病的病原有诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、类立克次氏体和分枝杆菌等(唐国盘，1982)。对水产动物结节病病原及其药物敏感性的研究，有利于水产科研工作者和一线养殖者了解掌握疾病的发生规律，从而为疫病的防控提供依据，为药物的合理使用提供参考。

2020年11月安丘市坊子区刘姓养殖户池塘饲养的乌鳢发生间断死亡，病鱼可见体色偏黑、反应迟钝、乏力、浮游于水面，体表有损伤并溃烂出血，严重者鳞片脱落、溃烂并形成较大的脓肿。为了尽快弄清病因，找到有效可行的防治方法，笔者对其病原及防治药物进行了研究，现将结果报告如下。

一、材料与方法

1.试验材料

(1)病鱼来源：病鱼于2020年11月采自安丘市，体长30～35厘米，个体重2～2.5千克。

(2)试剂耗材：胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购自国药集团化学试剂有限公司，110毫米直径定性滤纸购自杭州新华纸业有限公司，10%盐酸多西环素可溶性粉、5%硫酸新霉素粉、10%氟苯尼考可溶性粉、5%恩诺沙星粉、10%磺胺间甲氧嘧啶钠粉及30%阿莫西林可溶性粉由青岛中仁动物药品有限公司生产。

(3)主要仪器设备：震荡培养箱(HZQ-F160)、恒温培养箱(DHP-9052)和细菌浊度仪(WGZ-XT)。

2.试验方法

(1)临床症状及剖检：首先调查发病池塘水温、病鱼的鱼龄、苗种来源、病鱼在养殖池中的活动情况、死亡率等，并在现场进行解剖和观察，记录病鱼体外和体内的临床症状。

(2)寄生虫检查：分别取少量鱼体表黏液及鳃丝于载玻片上，加1滴无菌生理盐水，展开后用显微镜进行镜检。

(3)病原菌分离、鉴定：在无菌条件下，分别从病鱼的肝脏、肾脏组织中接菌，于TSA培养基上28℃恒温培养5～7天，挑取形态特征一致的优势菌落在TSA平板上多次划线纯化，直至得到形态一致、特征稳定的菌落，将纯分离物平板送至华大基因科技服务有限公司进行分子鉴定和测序。

(4)药敏纸片制作：为了节约药敏试验成本，药敏纸片自制，方法参照张浩(2018)和王传峰(2015)等的方法。利用打孔器将110毫米的定性滤纸打成直径为6毫米的圆形小纸片，放入清洁干燥的青霉素空瓶中，每瓶放入50片，用牛皮纸包好瓶口并用小线扎紧，高压灭菌(121℃，15分钟)，烘干，密封备用。抗菌药物的浓度统一选择100毫克/升，配置好后过滤除菌，然后吸取无菌药液1毫升加入装有纸片的青霉素瓶中，用牛皮纸密封瓶口，浸泡1小时，让药液被纸片充分吸净，空白对照采用无菌双蒸水按照同样方法制得；然后将纸片散开放入灭菌的培养皿中，无菌室搁置过夜，待纸片完全干燥后，收集在青霉素瓶内，密封，贴好标签，置于-20℃保存备用。

(5)药敏试验：药物敏感性试验采用纸片琼脂扩散法，参照何晟毓(2020)的方法并略有改动。将分离纯化的病原菌接种于TSA液体培养基，28℃恒温摇床震荡培养4～7天，将菌液用微量电动组织混匀器充分混匀后吸取200微升，参照麦氏比浊管调整菌液浓度为1.8×108CFU/毫升，在无菌环境下均匀涂布于整个平板。待培养基表面干燥后放置药敏纸片使其紧贴培养基表面，28℃恒温箱中培养3～7天，使用游标卡尺测量、记录抑菌圈直径大小，根据抑菌圈直径大小粗略判断同等浓度下不同药物的敏感性。

二、结果

1.临床症状及剖检结果

病鱼体表呈现斑点状溃疡、脓疮或出血，部分病鱼眼睛外凸，腹部异常肿大，解剖可见大量血性腹水，脾脏、肾脏、肝脏内外布满直径2～5毫米的黄白色结节，尤以肾脏最为严重，在后肾处形成巨大的囊肿物，部分病鱼按压皮肤会流出脓血(图1)。镜检未见寄生虫感染。

图1 病鱼体外和体内临床症状

2.细菌分离

将划线接种的TSA平板经28℃恒温培养4天后才有少许菌落生长。从患病乌鳢肝脏、肾脏、脾脏均分离得到同一种形态的优势菌，呈淡黄色沙粒状，菌落呈不规则凸起(图2)。将其命名为菌株ZRWL-16。

图2 分离菌在TSA培养基上的菌落形态

3.菌种鉴定结果

NCBI-BLAST比对显示，该株分离菌与Nocar-diaseriolaeUTF1(登录号为AP017900.1)序列相似性为99.72%，最终鉴定ZRWL-16菌株为诺卡氏菌。

4.药敏试验

分离菌ZRWL-16在TSA琼脂上生长良好，28℃培养96小时后能清楚判断抑菌圈大小(图3)。

图3 药敏试验结果

同等浓度下，该株诺卡氏菌对药物的敏感性从高到低依次为10%盐酸多西环素可溶性粉、10%氟苯尼考可溶性粉、10%磺胺间甲氧嘧啶钠、5%恩诺沙星和5%硫酸新霉素，抑菌圈直径分别为20.35、18.60、16.52、15.25、13.20毫米。

5.治疗方案

确诊为诺卡氏菌感染后，笔者推荐养殖户使用内服加外消的方法(抗菌＋提高免疫力＋修复肝脏损伤)进行治疗。建议先给乌鳢减料，使用聚维酮碘溶液对水体进行消毒，用量按说明书所示，隔1天用1次，进行1～2次，同时拌料内服“盐酸多西环素(或氟苯尼考)＋黄芪多糖＋肝胆康泰”，用量按具体产品说明，连续投喂7天，每天投喂1餐，并结合使用过硫酸氢钾产品连续改底两次。刘老板按照这个方案使用了5天，死鱼明显减少，8天后只有零星死亡，病情基本得到了控制。

三、讨论

由于诺卡氏菌为革兰氏阳性菌，临床上对革兰氏阳性菌敏感的药物不多，且该菌生长缓慢，潜伏期长，易在体内形成结节，导致治疗难度大(何晟毓等，2020；胡雄等，2019)。目前对该病的防治依赖于抗菌药物，根据本试验结果，该病病原对盐酸多西环素、氟苯尼考等较敏感。但在不同地域、不同养殖品种、不同养殖管理模式下，病原的药物敏感谱会有所不同。耐药性的增加和药物本身的副作用可能会导致养殖动物肝肾损伤，因此建议在选择敏感药物进行治疗的同时，搭配可以促进肝脏分泌胆汁、增强肝脏解毒和排毒功能的胆汁酸，或具有保肝护肝、调节免疫力、清热解毒的中草药提取物及消除应激的维生素等。最后，也是最重要的一条，一定要增强病害防控意识，做到“预防为主、防重于治”，并对症用药。