DNA四面体对嵌入式染料荧光各向异性的影响

黄秋灵 陈 静 李 江 诸 颖 王丽华

1（中国科学院上海应用物理研究所中国科学院微观界面物理与探测重点实验室 上海 201800）

2（中国科学院上海高等研究院基础交叉研究中心张江实验室 上海 201210）

3（中国科学院大学 北京 100049）

基于脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）结构的嵌入式染料的荧光各向异性主要用于嵌入染料的取向研究、核酸结构分析、纳米探针的构建、生物传感器等领域［1-5］。例如Peterman等利用花菁素类非对称嵌入式染料YOYO-1的荧光各向异性研究了染料在双链DNA中的取向变化［5］，并通过染料的荧光各向异性首次证实了S-DNA中碱基的排列［1］。Ravelet等利用SYBR Green I构建了荧光寿命敏感的荧光各向异性探针用于酪氨酸酰胺、腺苷分子和汞（II）离子的检测［3］。这些研究都是基于双链DNA的嵌入式染料荧光各向异性的变化进行的，而目前基于框架核酸的嵌入式染料荧光各向异性的研究则很少。

框架核酸（framework nucleic acids）是一类依据Watson-Crick碱基互补配对原则，设计并合成的一维到三维的核酸纳米结构，是一类具有独特物理、化学和生物学特性的新型核酸［6-7］。DNA四面体（DNA tetrahedrons，TDN）是一种典型的框架核酸，其生物相容性好，通过碱基序列的合理设计可精确调控TDN的尺寸。同时，相比于双链DNA结构，TDN还可实现功能基团在空间上的精确排布，降低功能基团之间的串扰，在生物传感、诊断、生物成像和药物递送等领域得到广泛应用［8-12］。因此利用TDN作为载体，对嵌入式染料的性质进行研究，有望构建新型的优异光学纳米探针。

本文设计了不同尺寸的TDN荧光各向异性分子探针，研究TDN的尺寸变化对不同类型的嵌入式染料的荧光各向异性的影响（图1）。

图1 基于TDN的嵌入式染料的荧光各向异性分子探针示意图Fig.1 Schematic diagram of the fluorescence anisotropy probe for intercalative dyes based on TDN

1 实验材料

1.1 实验试剂

所有的DNA均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Agarose琼脂糖（A21813）购自美国Bio-Rad公司；SYBR Green I购自苏州宇恒生物科技有限公司；DAPI购自碧云天生物技术有限公司；DiYO-1购自齐一生物科技（上海）有限公司。

1.2 实验器材

紫外分光光度计（UV-2600），日本SHIMADZU公司；荧光光谱仪（FS-5），英国Edinburgh公司；微量定量仪器（P300），上海舟卓科学仪器有限公司/百泰国际贸易（香港）有限公司；PCR仪器（T100），美国Bio-Rad公司；离心机（5417R），美国Eppendorf公司；电泳仪（PowerPac），美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统（G：BOX），美国Syngene公司；原子力显微镜（mode 8），美国Bruker公司。

2 实验方法

2.1 TDN的合成、纯化与表征

TDN的合成：将4条或者8条DNA单链等比例混合于TM缓冲液中，退火形成TDN。TM缓冲液的配 置 如 下：10 mmol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1MgCl2，pH=8.0。退火程序如下：95℃变形10 min，然后快速冷却至4℃保存。

TDN的纯化：由于退火过程中会形成聚体等其他结构，故通过高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）纯化收集TDN单体。HPLC流动相的配置如下：450 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1Tris-HCl，pH=7.2。并通过2%琼脂糖凝胶电泳进行表征。

2.2 样品制备与荧光各向异性测量

TDN和嵌入式染料复合物的制备。取TDN和嵌入式染料在TM缓冲液中混合，总体积为100μL，并在室温下避光孵育30 min。其中不同尺寸TDN的浓度均为100 nmol·L-1，三种嵌入式染料按照碱基对和染料的摩尔比为4:1的比例加入。

荧光光谱仪测量荧光各向异性。荧光各向异性的计算公式为：r=（Ip-Iv）/（Ip+2Iv），其中：Ip和Iv分别代表与激发光偏振方向平行和垂直的荧光强度。染料分子的激发波长和接收的范围分别如下：SYBR Green I的激发光为488 nm，荧光发射的接收范围为500～650 nm；DAPI的激发光为354 nm，荧光发射的接 收 范 围 为400～600 nm，DiYO-1的激发光为488 nm，荧光发射接收范围为500～650 nm。

3 实验结果与讨论

3.1 TDN的合成与表征

通过PCR退火形成棱长分别为7 bp、13 bp、17 bp、20 bp和37 bp的TDN。不同尺寸TDN的DNA序列如表1所示。在退火的过程中，形成的TDN不均一，因此首先利用HPLC对TDN进行了纯化，成功得到了均一的TDN单体。通过琼脂糖凝胶电泳进一步证明不同大小的TDN的成功合成（图2（a）），并利用同步辐射小角散射（Small Angle X-ray Scattering，SAXS）对DNA纳米结构进行表征（图2（b）），结果表明：TDN的尺寸与文献报道是一致的［13-16］。

表1 不同尺寸TDN的DNA序列Table 1 The DNA sequences of tetrahedron with varied edge length

图2 不同尺寸的TDN的表征(a)PAGE表征TDN，(b)同步辐射小角散射表征DNA纳米结构（M代表DNA marker，泳道1～5分别为棱长为7 bp、13 bp、17 bp、20 bp和37 bp的TDN）Fig.2 Characterization of tetrahedron with varied size(a)PAGE characterization of TDN,(b)SAXS characterization of DNA nanostructure(M representative DNA marker,lane 1 to 5 are tetrahedrons with edge length of 7 bp,13 bp,17 bp,20 bp and 37 bp,respectively)

同时，通过荧光光谱的测量得知，SYBR Green I，DiYO-1和DAPI分别与TDN结合之后，光谱分别蓝移了12 nm、27 nm和16 nm（图3）。

图3 嵌入染料与DNA结合前后的荧光光谱(a)SYBR Green I，(b)DAPI，(c)DiYO-1Fig.3 Fluorescence spectra of dyes and DNA/dyes complexes(a)SYBR Green I,(b)DAPI,(c)DiYO-1

3.2 TDN的尺寸大小对SYBR Green I和DAPI的荧光各向异性的影响

SYBR Green I是一种单嵌入式的染料分子，据文献报道，它与双链DNA主要以插入碱基对的模式相互作用［17］；DAPI也是一种单嵌入式的染料分子，而据文献报道，它与双链DNA主要以结合在双链DNA的小沟的模式相互作用［18］。我们将这两种具有不同单嵌入模式的染料分子分别与不同尺寸的TDN组装，研究了TDN尺寸大小对探针的荧光各向异性的影响。实验结果（图4）表明：随着TDN尺寸的增加，两种单嵌入式染料分子的荧光各向异性都有所增加。

图4 不同尺寸TDN对SYBR Green I(a)和DAPI(b)的荧光各向异性的影响Fig.4 The effect of tetrahedrons with different size on the fluorescence anisotropy of SYBR Green I(a)and DAPI(b)

根据之前的研究报道［19-22］，荧光各向异性与分子布朗运动引起的旋转扩散直接相关，而分子在溶液中的旋转扩散直接影响其旋转相关时间（θ），故荧光各向异性与荧光复合物的旋转相关时间十分相关。同时由于布朗运动的存在，θ的大小取决于溶液的粘度、温度和荧光复合物的分子大小。所以当荧光复合物的分子质量增加，θ增加，荧光各向异性增加；当荧光复合物的分子质量降低，则θ减小，荧光各向异性降低。因此，SYBR Green I和DAPI的荧光各向异性随着TDN尺寸的增加而逐渐增加，是因为随着TDN尺寸增加，分子探针的运动减慢，旋转相关时间增加，从而导致了荧光各向异性增大。对TDN-SYBR Green I复合探针，与TDN棱长为7 bp时相比，染料的荧光各向异性随着TDN棱长的增加分别增加了0.009、0.047、0.095和0.106。对TDN-DAPI复合探针，与TDN棱长为7 bp时相比，荧光各向异性分别增加了0.010、0.042、0.046和0.054。实验结果表明：不同尺寸的TDN对SYBR Green I的荧光各向异性的影响更为显著。

3.3 TDN的尺寸大小对DiYO-1的荧光各向异性的影响

DiYO-1是一种双嵌入式的染料分子，据文献报道，它与双链DNA主要以嵌入相邻碱基对的双嵌入模式相互作用［4］。我们对这种双嵌入模式的花菁素非对称染料分子和不同尺寸的TDN组装后的荧光各向异性进行了研究。实验结果表明：随着TDN尺寸的增加，探针的荧光各向异性先降低后增加（图5）。当TDN的棱长小于20 bp时，与TDN棱长为7 bp时相比，染料分子的荧光各向异性随着棱长的增加而分别降低了0.022、0.055、0.058。当TDN的棱长从20 bp增加到37 bp时，染料分子的荧光各向异性增加了0.018。

图5 DiYO-1嵌入棱长为7～37 bp的TDN后的荧光各向异性Fig.5 The fluorescence anisotropy values of DiYO-1 after intercalating tetrahedrons with edge length of 7 to 37 bp

据文献报道，DiYO-1与DNA相互作用之后，DiYO-1的结构发生了变化［23］，而结构的变化导致光物理性质的变化［24］，会引起荧光各向异性变化。所以我们认为在TDN-DiYO-1复合探针中存在两种影响染料荧光各向异性的因素：1）DiYO-1结构的变化对荧光各向异性的影响；2）荧光复合物的分子质量对荧光各向异性的影响。7～20 bp的棱长范围内，染料分子构象的变化对荧光各向异性的影响起主导作用，可能导致了染料的荧光各向异性逐渐降低；而当TDN的棱长大于20 bp时，荧光复合物的分子质量的影响起主导作用，即分子探针的整体旋转相关时间占主导地位，导致荧光各向异性随着棱长而增大。

4 结语

本工作以生物相容性好的TDN作为载体，构建了嵌入式染料的荧光各向异性探针。研究了不同尺寸大小的TDN对嵌入式染料荧光各向异性的影响。对于SYBR Green I和DAPI单嵌入式染料分子，染料的荧光各向异性会随着TDN的尺寸而增加，主要原因是随着TDN的尺寸的增加其质量增加，使得分子探针旋转相关时间的增加，进而增加了其探针的荧光各向异性。同时我们发现，对于DiYO-1这种花菁素类的双嵌入式染料，染料的荧光各向异性会随着TDN的尺寸的增大先减小再增大。主要原因是DiYO-1双嵌入式染料分子的荧光各向异性不仅与分子探针的旋转相关时间有关，还会受到染料与

TDN相互作用的影响。当DiYO-1与TDN的相互作用占主导时，DiYO-1的构象变化可能减小了其荧光各向异性；当复合探针的旋转相关时间占主导时，荧光各向异性随TDN质量而增加。本工作系统地研究了不同尺寸TDN对嵌入式染料荧光各向异性的影响，通过精确调控TDN尺寸可以实现对荧光染料各向异性的调控。该工作的探索有利于实现具有精确调控能力的荧光各向异性探针的构建，为提高荧光各向异性多靶标检测奠定了基础。