治疗肺纤维化的吡非尼酮pH敏感脂质体的制备和体外释放

韩美珊,朱效素,吕晓燕,刘 沙,孙考祥

(烟台大学药学院,新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室,山东 烟台 264005)

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种间质性肺疾病,患者肺部纤维化组织的异常增生会导致肺功能的进行性和不可逆性的丧失[1]。IPF的患病例数为每10万人中494.5例,患者的中位生存期仅为2～3a,死亡率甚至高于某些癌症[2-3]。吡非尼酮是2014年FDA批准上市用于治疗肺纤维化的一种口服的吡啶酮类化合物,体外实验和药效试验证明吡非尼酮具有抗氧化、抗炎及抗纤维化的作用[4-5]。目前,吡非尼酮已上市的剂型为胶囊和片剂,但口服给药存在严重的胃肠道不良反应及全身性光敏反应,患者的耐受性差,同时药物的体内半衰期短,仅为2.2 h[6]。因此,开发出一种能够靶向病变部位,延长药物的半衰期并降低不良反应的缓释制剂是十分必要的。

据文献报道,因为慢性炎症的存在,特发性肺纤维化的微环境呈酸性[7],本研究首次构建响应于酸性微环境的pH敏感脂质体,包载吡非尼酮,使药物在呈酸性的病变部位释放,降低药物在周围组织的蓄积,增加药物的有效量,从而达到提高药物的靶向性、降低用药剂量,延长药物半衰期的目的。实验分别采用薄膜分散法、改良的乙醇注入法和硫酸铵梯度法制备吡非尼酮pH敏感脂质体,其中薄膜分散法和改良的乙醇注入法的包封率相对较低,而硫酸铵梯度法制备的脂质体包封率较高、粒径较小。通过葡聚糖微柱离心法纯化脂质体,紫外分光光度法测定药物含量,采用包封率和粒径作为指标考察吡非尼酮pH敏感脂质体的最佳制备方法,确定最佳工艺,为后续开发吸入型肺部给药的脂质体制剂奠定基础。通过体外释放实验考察吡非尼酮脂质体的pH响应性,为吡非尼酮新型递药系统的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

IKA旋转蒸发仪(德国IKA公司),DF-101Z集热式恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司),电子分析天平(美国Mettler Toledo公司),Nicomp 380 ZLS激光粒度仪(美国PSS公司),离心机Primo R(美国SORVALL公司),UV-2450紫外分光光度仪(日本SHIMADZU公司),微量脂质体挤出器(加拿大AVESTIN公司)。吡非尼酮(上海士锋生物科技有限公司),二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(上海艾韦特医药科技有限公司,批号:D0104),半琥珀酸胆固醇(CHEMS)(美国Sigma公司),硫酸铵(天津市致远化学试剂有限公司),氯化钠(天津市恒兴化学试剂制造有限公司),葡聚糖凝胶 G-50(华中海威基因科技有限公司),无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司),甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制备方法的考察 薄膜分散法:取DOPE、CHEMS和吡非尼酮按比例溶于适量无水乙醇,将溶解的膜材转移至圆底烧瓶中,在旋转蒸发仪上旋转成膜。成膜后于50 ℃温度下水合20 min,制得的脂质体使用手动挤出器(100 nm)反复挤出12次,即得吡非尼酮pH敏感脂质体。

改良的乙醇注入法:取DOPE、CHEMS和吡非尼酮按比例溶于适量无水乙醇,将溶解的膜材转移至圆底烧瓶中,将圆底烧瓶置于50 ℃水浴加热挥除无水乙醇,成膜后加入预热好的4 mL超纯水,50 ℃搅拌水合20 min,制得的脂质体使用手动挤出器(100 nm)反复挤出12次,即得吡非尼酮pH敏感脂质体。

硫酸铵梯度法:取DOPE、CHEMS和吡非尼酮按比例溶于适量无水乙醇,将溶解后的膜材转移至圆底烧瓶中,将圆底烧瓶置于50 ℃水浴加热挥除无水乙醇,成膜后匀速注入预热的硫酸铵溶液,50 ℃搅拌水合20 min,制得的脂质体使用手动挤出器(100 nm)反复挤出12次,即得空白脂质体。将空白脂质体置于透析袋内,于生理盐水中透析6 h,除去脂质体外水相中的硫酸铵。取适量的吡非尼酮溶液与空白脂质体混合,55 ℃孵育15 min即得吡非尼酮pH敏感脂质体。

1.2.2 吡非尼酮含量测定方法的考察 最大吸收波长的确定:取适量的吡非尼酮溶于甲醇,配制一定质量浓度的吡非尼酮甲醇溶液,采用甲醇作为对照溶液,通过紫外分光光度计在190 ～ 400 nm波长范围内扫描吡非尼酮的最大吸收波长。

吡非尼酮标准溶液的配制:配制质量浓度为5、7.5、10、15、20、25 μg/mL的一系列吡非尼酮甲醇溶液,选择317 nm作为吡非尼酮的最大吸收波长测定吸光度,以吸光度A对质量浓度c(μg/mL)绘制标准曲线。

精密度的考察:配制高、中、低质量浓度的吡非尼酮甲醇溶液,日内连续5次测量吸光度,连续测定5 d,计算日间精密度和日内精密度。

重现性的考察:配制质量浓度为10 μg/mL的吡非尼酮甲醇溶液,连续测定5次,考察测量方法的重现性。

方法回收率实验:配制高、中、低质量浓度的吡非尼酮甲醇溶液,测定吸光度后,代入标准曲线计算浓度记为c0,与配制浓度c1相比检验方法回收率。方法回收率=c0/c1×100%。

1.2.3 单因素考察 通过比较三种制备方法,选择硫酸铵梯度法作为脂质体的制备方法。采用单因素考察法对制备参数进行优化,以包封率和粒径作为指标,控制其他因素不变,改变单一变量,对磷脂与胆固醇的比例、药物与磷脂的比例、硫酸铵溶液的浓度、孵育温度以及孵育时间进行考察,确定最优处方。

磷脂与胆固醇的比例:保持“1.2.1”项下硫酸铵梯度法中其他条件不变,考察DOPE∶CHEMS为1∶1,1.5∶1和2∶1时脂质体的包封率和粒径,确定最佳的磷脂与胆固醇的比例。

药物与磷脂的比例:保持“1.2.1”项下硫酸铵梯度法中其他条件不变,考察吡非尼酮与DOPE比为1∶7,1∶10和1∶15时脂质体的包封率和粒径,选择最佳药脂比。

硫酸铵溶液的浓度:保持“1.2.1”项下硫酸铵梯度法中其他条件不变,考察硫酸铵溶液浓度分别为150、200和250 mmol/L时脂质体的包封率和粒径,选择最佳的硫酸铵溶液浓度。

孵育温度:保持“1.2.1”项下硫酸铵梯度法中其他条件不变,考察孵育温度分别为50、55和60 ℃时脂质体的包封率和粒径,选择最佳的孵育温度。

孵育时间:保持“1.2.1”项下硫酸铵梯度法中其他条件不变,考察孵育时间分别为10、15和20 min时脂质体的包封率和粒径,选择最佳的孵育时间。

1.2.4 吡非尼酮pH敏感脂质体的表征 包封率和载药量的测定:选择葡聚糖凝胶法纯化脂质体[8],取200 μL纯化后的脂质体用甲醇破乳并定容至5 mL,吸光度记为A0。取200 μL未纯化的脂质体同样用甲醇破乳定容至5 mL,吸光度记为A1。经紫外测定吸光度后,根据标准曲线计算质量浓度c和包封率:包封率=c0/c1×100%。

根据测定的质量浓度,得到脂质体内的吡非尼酮的量并计算载药量(DL):

DL=We/Wm×100%。

式中，We表示包封于脂质体内的药量，Wm表示载药脂质体的总质量。

形态、zeta电位和粒径的测定:取10 μL制备好的脂质体滴于带有碳支持膜的铜网上,3 min后使用滤纸从铜网边缘吸走多余的脂质体,取10 μL 体积分数为2%的磷钨酸溶液(pH 7.4)滴于铜网上,自然干燥后置于透射电镜中观察脂质体的形态与结构。取1 mL吡非尼酮脂质体用蒸馏水稀释4倍后,置于比色皿中,采用Nicomp 380 ZLS激光粒度仪测量粒径与电位。

体外释放实验:取1 mL吡非尼酮pH脂质体置于透析袋内,将透析袋放入分别装有50 mL pH 7.4和pH 5.5的PBS的离心管中,采用水浴恒温震荡法,摇床的条件设置为100 r/min,温度为37 ℃。分别于0.083、0.5、1、2、4、8、24、48 h取1 mL释放介质,并补充1 mL PBS。采用紫外分光光度法测量并计算累积释放度。

2 结 果

2.1 制备方法的考察

采用薄膜分散法和改良的乙醇注入法制备的脂质体,包封率较低,脂质体较浑浊。硫酸铵梯度法制备的脂质体包封率高且粒径较小(表1),因此最终选择硫酸铵梯度法作为制备方法。

表1 不同制备方法的包封率和粒径(n=3)

2.2 吡非尼酮含量测定方法

2.2.1 吡非尼酮最大吸收波长的选择 如图1所示,吡非尼酮在1处和2处皆有最大吸收,但2处为近紫外端且空白脂质体在此处也有吸收,所以选择1处的317 nm作为吡非尼酮的最大吸收波长。

图1 紫外最大吸收波长扫描图

2.2.2 标准曲线 由吸光度A对质量浓度c做回归方程得y=0.025x+0.078 1,R2=0.999 7,表明吡非尼酮在质量浓度范围为5～25 μg/mL之间线性良好(图2)。

图2 吡非尼酮溶液标准曲线

2.2.3 精密度考察 测定结果表明,吡非尼酮溶液的三个质量浓度的日内和日间精密度的RSD均小于1%,表明测量方法的精密度良好(表2)。

表2 吡非尼酮溶液日内精密度测定结果(n=5)

2.2.4 重现性的考察 同一吡非尼酮溶液连续5次测量的质量浓度分别为10.09、10.11、10.07、10.15、10.13 μg/mL,RSD为0.31%小于1%,表明测量方法的重现性良好。

2.2.5 方法回收率的考察 结果表明,测定方法的回收率在100.84%～101.4%之间,方法回收率良好(表3)。

表3 吡非尼酮溶液方法回收率测定结果(n=5)

2.2.6 单因素考察 通过单因素考察,确定吡非尼酮脂质体的最佳处方工艺为n(DOPE)∶n(CHEMS)=1.5∶1,m(吡非尼酮)∶m(DOPE)=1∶10,硫酸铵浓度为250 mmol,孵育时间为15 min,孵育温度为55 ℃(表4)。按照最佳处方制备的脂质体包封率高,粒径较小,脂质体呈略带蓝色乳光的半透明溶液。

表4 关键因素对脂质体包封率和粒径的影响(n=3)

2.3 吡非尼酮pH敏感脂质体的表征

2.3.1 包封率和载药量的测定 按照单因素考察确定的最佳工艺制得的脂质体包封率为90.1%,载药量为6.3%,可以满足实验需求。

2.3.2 形态、zeta电位和粒径的测定 由图3可以看出,脂质体分散性良好,粒径较为均一,形态完整,为球形和类球形,虽然制备电镜样品时的干燥过程使脂质体的形态因失水而略受影响,但仍然可以清楚地看到脂质体的双层膜结构。多次测量所得平均粒径在109.0±3.4 nm左右(图4),多分散指数为0.061,粒径分布较为均匀,略带负电(图5)。

图3 pH敏感脂质体透射电镜照片

图4 吡非尼酮pH敏感脂质体的粒径分布

图5 吡非尼酮pH敏感脂质体的电位分布

2.4 释放度实验

如图6所示,吡非尼酮pH敏感脂质体在pH为5.5的PBS中释放较快,24 h内可释放80%左右,在pH为7.4的PBS中释放较慢,24 h内可释放50%左右。CHEMS在pH小于5.8的条件下酸敏感性良好,因此脂质体在pH为5.5的条件下释放迅速,pH敏感性显著,能够达到在疾病部位快速释放的目的。

图6 吡非尼酮pH敏感脂质体在不同pH条件下的体外释放曲线

3 讨 论

pH敏感脂质体是主动靶向制剂的一种,可以响应于疾病的微环境释放药物,从而增加药物的靶向性,减少药物的用量,降低不良反应[9]。脂质体的制备方法主要有被动载药法和主动载药法。被动载药法是传统常用的制备方法,实验设计采用薄膜分散法和改良的乙醇注入法制备吡非尼酮脂质体,但是包封率较低。因为吡非尼酮是两亲性药物,可尝试使用主动载药法中的硫酸铵梯度法制备,以提高脂质体的包封率。实验结果表明硫酸铵梯度法制备的脂质体包封率较高,可以满足后续实验的需求[10]。同时,本研究的靶向部位为肺部,研究表明200 nm以下的脂质体更适合肺部给药,且进入肺部后,粒径越小脂质体的滞留时间越长[11],而相比被动载药法,硫酸铵梯度法制备的脂质体粒径较小,在100 nm左右,更适于肺部给药。经对比硫酸铵梯度法是制备吡非尼酮脂质体的最佳工艺。pH敏感脂质体常使用DOPE和CHEMS作为制备材料,DOPE在单独存在的状态下呈不稳定的六角相结构存在,加入CHEMS后形成稳定的双分子层结构。在酸性条件下,CHEMS会因为质子化从而使DOPE又恢复到不稳定的六角相结构,因此实验采用DOPE和CHEMS作为制备吡非尼酮pH敏感脂质体的膜材。实验经过处方筛选确定硫酸铵梯度法作为脂质体的制备方法,通过单因素考察优选最佳参数,控制脂质体的粒径,为日后制备吸入型脂质体奠定基础。在体外释放实验中,脂质体在弱酸性环境中表现出良好的pH响应性,可达到脂质体在肺纤维化部位的快速释放,从而提高药物在病变部位的积累量,降低全身毒性,为吡非尼酮的扩大应用和特发性肺纤维化的治疗提供思路。