MiR-27b-3p靶向ID-3调控骨肉瘤细胞增殖的研究

李志强，刘树江，沈朝，郝玉升，吴文杰，苑萌萌

(河北省沧州市人民医院骨科，河北 沧州 061000)

骨肉瘤好发于儿童和青少年，病理形态中观察到明确的肿瘤性骨细胞形成，恶性程度较高，并具有高增殖的特征[1]。DNA结合/分化抑制蛋白-3(DNA binding/differentiation inhibitory protein-3，ID-3)是近年关注到与肿瘤形成相关的因子，其在骨肉瘤中表达上调，能抑制细胞分化，促进肿瘤细胞增殖和侵袭。有学者发现微小RNA(microRNA，miRNA)是ID-3的上游因子[2]。miRNA是近年关注到的与肿瘤形成有关的非编码单链小RNA，由19～25个核苷酸组成，通过与目标基因的3′非翻译区结合，调控病变的形成和进展[3]。我们应用生物信息分析进行筛选，发现微小RNA-27b-3p(microRNA-27b-3p，miR-27b-3p)在骨肉瘤中可能异常表达，同时应用TargetScan和Mirtarbase预测到ID-3可能是miR-27b-3p下游的靶基因(见图1)。基于此，本实验检测骨肉瘤细胞系和肿瘤病变组织中miR-27b-3p的表达，分析miR-27b-3p靶向ID-3对肿瘤细胞增殖的调节作用。

图1 miR-27b-3p与ID-3可能的碱基互补序列

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞系U20S购于中国科学院上海细胞生物学研究所。应用RPMI 1640培养基(美国Gibco公司，货号SS16-1209)进行培养。兔抗人ID-3多克隆抗体(武汉博士德生物技术公司，货号DR106629-16，稀释倍数1∶4 000)和兔抗人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗体(武汉博士德生物技术公司，货号DR108525-10，稀释倍数1∶4 000)，RIPA裂解液(RIPA lysis buffer，RIRP)(武汉博士德生物技术公司，货号DR106623-12)、胰酶消化液(武汉博士德生物技术公司，货号DR106965-01)、质粒提取试剂(武汉博士德生物技术公司，货号DR109623-03)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(武汉博士德生物技术公司，货号DR106690-15)、羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司，货号DR100023-08，稀释度1：3500)及二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)(武汉博士德生物技术公司，货号DR100025-05)。Lipofetamine 2000(Invitrogen公司，货号6958-7415)和双荧光素酶试剂盒(Invitrogen公司，货号0152-1098)。引物由上海吉玛生物合成，细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(北京索莱宝生物公司，货号CH-171502A)。采用MK3型酶标仪(美国Thermo公司)及IQ5聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(美国Bio Rad公司)。

1.2 临床资料 纳入标准：(1)首次发病并手术切取病变组织，经病理确诊，符合世界卫生组织(world health organization，WHO)中的标准。(2)临床及病理资料齐全。排除标准：(1)诊断不明确或合并有其他肿瘤成份；(2)术前行放、化疗；(3)伴有严重内科疾病。根据纳入与排除标准，应用前瞻性研究方法选择2016年1月至2017年4月确诊为骨肉瘤的患者40例，其中男22例，女18例；年龄4～88岁，平均(16.3±4.3)岁。留取新鲜的肿瘤组织(-80℃冻存)。患者或家属均签定知情同意书，研究经医院伦理委员会批准(医学伦理批准文号2016-0105A)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 细胞复苏后，应用10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每2天更换1次培养基，当细胞生长达到80%的融合度时，接种于12孔板，将细胞密度调至5×105个/孔。构建质粒进行细胞转染，建立空白对照组(NC组)、空载体转染组、miR-27b-3p mimic组、miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共转染组，严格按说明书操作。空白对照组：不做转染。空载体转染组：转染空质粒。miR-27b-3p mimic组：转染含miR-27b-3p mimic质粒(miR-27b-3p mimic由上海吉玛基因公司合成)。miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共转染组：共同转染含miR-27b-3p mimic质粒和含siRNA ID-3质粒(miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3由上海吉玛基因公司合成)。

1.3.2 双荧光素酶报告基因实验 检测miR-27b-3p对ID-3 3'非翻译区(3' untranslated region，3' UTR)结合情况。将含有ID-3 mRNA 3'UTR的野生型(pGL3-ID-3-WT)和突变型(pGL3-ID-3-MT)报告质粒，分别同miR-27b-3p mimic、空白对照共转染到人骨肉瘤细胞株U2OS中，转染3 h后换液，在5% CO2、37℃培养箱中继续培养48h后观察荧光素酶活性。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)实验 应用RT-qPCR检测miR-27b-3p的表达。Trizol提取总RNA。miR-27b-3p引物上游：5＇-TCGAAAACTGGCCAAGCCTGC-3＇，下游：5＇-TGCTTAAATCCAGGAATTGCT-3＇。U6为内参，引物上游：5＇-GGCAGAAAGATTAGC-3＇，下游：5＇-TTGGAACGCAAATTCCG-3＇。应用逆转录法合成cDNA。扩增程序：95℃ 15 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共30个循环。于60℃采集信号。读取CT值，以2-ΔΔCT法表示结果。ΔΔCT=[CT目的基因(未知样品)-CT对照(未知样品)]-[CT目的基因(校正样品)-CT对照(校正样品)]。

1.3.4 免疫组化实验 免疫组化二步法检测骨肉瘤石蜡包埋组织中ID-3和PCNA的表达。切取4μm切片，DAB显色。ID-3的表达部位是细胞质和/或细胞膜，PCNA的表达部位是细胞核，随机选择5个400倍视野(热点区)，计算阳性率，取平均值。

1.3.5 Western Blot实验 应用Western Blot法检测ID-3和PCNA的表达。基于新鲜组织，提取总蛋白，依次完成蛋白变性、加样、电泳、电转膜、免疫杂交步骤后取出膜加入发光液，胶片盒曝光3 min，显影15 s。以目的蛋白与GAPDH的比值作为定量结果进行分析。

1.3.6 CCK-8法检测细胞活性 各组细胞消化转染后按每孔3 000个左右接种，孵育过液，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h，酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光值。细胞活力计算公式：细胞活力(%)=(Absample-Abbland)/(Abcontrol-Abbalnd)×100%。

1.3.7 集落形成实验 消化转染后的细胞收集到离心管中，计算细胞浓度，在6孔板中每孔加入500个细胞，每组设3个复孔，每48 h更换培养基1次，培养14 d后吸走培养基，加入无水乙醇固定20 min，再用0.5%的结晶紫染色20 min，去离子水清洗观察。

2 结 果

2.1 双荧光素酶报告基因实验结果 构建含有野生型ID-3 mRNA 3'UTR的pGL3-basic质粒(pGL3-ID-3-WT)，构建含有miR-27b-3p结合位点缺失的突变型ID-3 mRNA 3'UTR的质粒(pGL3-ID-3-MT)。分别与空白对照组(NC)、miR-27b-3p mimic组进行培养，检测荧光素酶的表达。结果发现miR-27b-3p mimic与pGL3-ID-3-WT共转染组的细胞系中荧光素酶活性显著降低，而与 pGL3-ID-3-MT共转染的细胞系中无明显变化，提示miR-27b-3p与ID-3的3'UTR具有结合的能力(见图2)。

注：*P<0.05

2.2 各组细胞增殖能力 检测转染第0～5天细胞的活性。相对于空白对照组、空载体转染组，miR-27b-3p mimic组细胞活性于第2天开始下降，持续到第5天，而共转染组能够逆转miR-27b-3p mimic组的细胞活性(见图3)。

图3 各组细胞增殖能力

2.3 各组细胞中ID-3和PCNA的表达 相对于空白对照组、空载体转染组，miR-27b-3p mimic组ID-3和PCNA的表达均下降，而共转染组能逆转上述改变(见图4～5)。

图4 各组细胞中ID-3和PCNA的表达

图5 各组细胞中ID-3和PCNA的表达

2.4 各组细胞集落形成实验 相对于空白对照组的(51.2±4.3)个、空载体转染组的(48.8±3.9)个，miR-27b-3p mimic组(31.5±6.7)个中肉眼可见的克隆集落数量明显减少，而共转染组能逆转上述改变(47.4±4.4)个(见图6～7)。

图6 集落形成实验图 图7 集落形成实验柱状图

2.5 骨肉瘤中miR-27b-3p与ID-3、PCNA的相关分析 采用RT-qPCR法检测骨肉瘤中miR-27b-3p的表达量为1.2～4.3，平均(2.5±0.8)。免疫组化检测ID-3的阳性率为6%～70%，平均(34.3±9.0)%；PCNA增殖指数8%～85%，平均(46.5±8.8)%。相关分析显示miR-27b-3p与ID-3(r=-0.58，P=0.014)、miR-27b-3p与PCNA(r=-0.54，P=0.021)呈负相关性，ID-3与PCNA(r=0.52，P=0.030)呈正相关性(见图8～9)。

图8 骨肉瘤中miR-27b-3p溶解曲线(RT-qPCR)

a PCNA的表达 b ID-3的表达

2.6 miR-27b-3p表达与生存时间的关系 患者均进行术后3年(36个月)生存时间的随访，截止时间点为2020年4月30日。其中存活19例，死亡20例，失访1例。死亡患者生存时间为6～36个月，中位生存时间为25个月。生存分析显示miR-27b-3p的表达与生存时间相关，即miR-27b-3p低表达患者的预后差(见图10)。

图10 miR-27b-3p表达的生存分析

3 讨 论

骨肉瘤常用的细胞株包括鼠源性细胞株S-SLM、K7M2、Kl2、UMR106-01、Dunn、LM7、LM8和人源性细胞株MG-63、POS-l、HOS-58及SAOS-2等。ID-3在人源性细胞株包括MG-63、POS-l、HOS-58及SAOS-2中均有表达。人骨肉瘤细胞株U2OS是由Ponten和Saksela在1964年从一名15岁女孩的胫骨中等分化的肉瘤中分离建立。从体外培养看，人骨肉瘤细胞株U2OS增殖速度快于其他细胞株，且细胞呈多形性。U2OS构建的裸鼠移植瘤模型生长速度块，有很明显的生长趋势，恶性程度中等，裸鼠存活期大约68 d，允许研究人员有足够的时间对其进行干预和研究，且移植瘤瘤体较大，便于操作和观察。骨肉瘤的形成涉及DNA、RNA及蛋白的异常表达[4-5]。近年关注到miRNAs的表达失调是肿瘤形成的重要促进因子，其作用途径主要是通过调控靶基因实现[6]，主要涉及细胞增殖、凋亡、迁移及分化的各种生物学过程。microRNA在人类各种肿瘤中扮演着重要的角色，作为致癌基因和抑癌基因，主要作用机制包括调控基因扩增、缺失、突变和转录因子的异常表达等。miR-27b-3p可以促进骨肉瘤细胞的增殖，但临床中尚未明确其调控骨肉瘤细胞的途径和通路[7]。miR-27b-3p是我们关注的重要因子，其异常表达是肿瘤形成的关键事件。ID-3是筛选出的与miR-27b-3p具有互补配对序列的因子，二者均参与细胞增殖和细胞周期的调控中。分化差的肿瘤常伴有ID-3的高表达，这类细胞具有“永生化”的特征[8]。ID-3具有阻止细胞分化的作用，细胞趋于原始，肿瘤呈高度的侵袭性及增殖活性[9]。也有学者认为ID-3是诱导癌基因形成的因子之一，主要调节细胞增殖、血管生成及抑制凋亡[10]。本实验中应用PCNA作为标记增殖指标的因子，效果理想，能客观反映其所标记细胞的增殖特征。

实验显示骨肉瘤细胞系中miR-27b-3p能引起转染pGL3-ID-3-WT的细胞中荧光素酶活性降低，提示miR-27b-3p能与ID-3的3'UTR区结合，证实了在TargetScan和Mirtarbase预测到的miR-27b-3p与ID-3具有互补序列的结果，也提示二者具有靶向关系。结果显示miR-27b-3p mimic组细胞活性明显下降、克隆集落数量明显减少、PCNA的表达下调，而miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共转染组能逆转上述表达水平，提示miR-27b-3p和ID-3结合后对调控细胞增殖有重要作用，即miR-27b-3p通过负调控ID-3抑制骨肉瘤细胞的增殖。骨肉瘤组织中发现miR-27b-3p与ID-3、miR-27b-3p与PCNA、ID-3与PCNA具有相关性，间接证实了上述结论。ID-3对细胞增殖调控通路是骨肉瘤形成过程中细胞失控性增生时的重要通路，ID-3高表达时细胞停滞于S期，细胞活性增强。MiR-27b-3p低表达时促进ID-3对细胞增殖的作用。有资料显示miR-27b-3p在正常的间叶源性组织中有一定的表达，而在间叶源性恶性肿瘤和自身免疫性疾病中常伴有miR-27b-3p表达的下调，对肿瘤微环境的形成有一定的影响[11-12]。MiR-27b-3p可能作为肿瘤抑制基因发挥作用[13]，其下游基因较多，本实验观察到的ID-3即为重要的下游基因[14]。但我们也观察到miR-27b-3p在肿瘤中的作用是复杂的，如对FZD7的调控发挥抑制肿瘤进展的作用[15]，通过对Bmal1的调节抑制肝细胞的异型增生等[16]。研究显示[17]，加入miR-27b抑制剂可以抑制骨肉瘤细胞SAOS-2细胞的增殖。miR-27b-3p可通过调控靶基因CDH11而影响宫颈癌细胞的生物学行为，促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力，促使宫颈癌细胞发生上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，从而促进宫颈癌的发生发展[18-20]。因此，miR-27b-3p在肿瘤中是个多功能的因子[21-22]，从细胞学实验证明，miRNA-27b-3p可以促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，对miR-27b-3p下游多项靶基因调控的研究有重要意义。结果观察到miR-27b-3p的表达与生存时间相关，提示miR-27b-3p的表达与预后有关，miR-27b-3p可能是判断骨肉瘤预后的独立危险因子。但是关于miR-27b-3p在肿瘤预后判断中的具体价值需要后续研究进行多中心、大样本、多因素分析后进一步明确。

综上所述，miR-27b-3p低表达是骨肉瘤形成的重要分子事件，表明miR-27b-3p可能为一个潜在的靶点用于骨肉瘤治疗。MiR-27b-3p靶向负调控ID-3抑制骨肉瘤细胞的增殖，MiR-27b-3p的表达与肿瘤的预后相关。