高效分子排阻色谱法测定滇黄精多糖的分子量*

顾 健 ，吴 伟 ，沈志冲 ，刘江云

（1. 江苏省南通卫生高等职业技术学校，江苏 南通 226007； 2. 苏州大学医学部药学院，江苏 苏州 215123）

黄精收载于2020 年版《中国药典（一部）》，为百合科植物滇黄精 Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精 Polygonatum sibiricum Red. 或多花黄精 Polygonatum cyrtonema Hua 的干燥根茎［1］，始载于《神农本草经》，具有补气养阴、润肺益肾功效。汉代《名医别录》记载，黄精为药食同源中药。黄精对免疫功能低下、恶性肿瘤、抑郁症、糖尿病、老年痴呆等都有一定的辅助治疗作用。其主要功效成分黄精多糖［2－6］为由葡萄糖单元为主构成的高分子聚合物，结构组成特征可为质量分析提供基础［7－9］。滇黄精为云南的道地药材，个大，多糖含量高，市场占有率最高［10－12］。本研究中建立了测定滇黄精中黄精多糖分子量的高效分子排阻色谱（HPSEC）法，为滇黄精的质量评价提供依据［13－14］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司），配有Shodex RI－101 型示差检测器（日本岛津公司）和EC2000 GPC 软件（大连依利特分析仪器有限公司）；LE204E 型分析天平（瑞士 Mettler 公司，精度为0.000 1 g）；TC6K 型电子天平（双杰兄弟集团，精度为0.1 g）。

1.2 试药

滇黄精药材采自云南普洱，经苏州大学陆叶副教授鉴定为滇黄精 Polygonatum kingianum coll.et Hemsl. 的根茎。葡聚糖包括 T2000，T200，T110，T70，T40，T20，T10，重均分子量（ Mw）见表1，购自默克试剂公司；葡萄糖（分析纯，上海国药集团化学试剂公司）；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验［15］

色谱柱：TSKG3000PWXL 型凝胶柱（300mm×7.8mm，10 μm），配有 Shodex RI－101 型示差检测器；检测波长：210 nm；流动相：纯水；流速：0.5 mL ／min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。在此色谱条件下，测得葡聚糖2 000 的保留时间（tR）为 9.43 min，葡萄糖的 tR为 19.16 min。葡聚糖对照品 T200 ～T10 和黄精多糖样品的 tR值均在9.43 ～ 19.16 min 范围内。

2.2 样品与溶液制备

滇黄精多糖样品：取滇黄精药材500 g，用蒸馏水5 L回流提取1.5 h，残渣同法回流1 次，合并提取液，缓慢添加乙醇至终浓度50%，静置过夜，过滤，60 ℃干燥得黄精多糖组分PK－F1 43.6 g；滤液继续添加乙醇至终浓度75%，同法静置，过滤，干燥得组分PK－F2 31.2 g；滤液浓缩至250 mL，同法添加乙醇至终浓度90%，静置，过滤，干燥得组分 PK－F3 16.8 g。

对照品溶液：分别取1.2 项下葡聚糖各25mg，置5mL容量瓶中，加水加热溶解，定容，即得。

供试品溶液：分别取上述PK－F1，PK－F2，PK－F3样品各25 mg，精密称定，置5 mL 容量瓶中，加水加热溶解，定容，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：吸取2.2 项下系列葡聚糖对照品溶液进样检测，记录色谱峰的 tR。以葡聚糖的 tR为横坐标、Mw 的对数值（lg Mw）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 lg Mw ＝ － 0.346 9 tR＋ 8.823 7（R2＝ 0.995 5），表明该条件下线性符合要求。详见表1。

表1 葡聚糖对照品线性关系考察结果Tab.1 Results of linear relation test of dextran reference

精密度试验：吸取2.2 项下葡聚糖T110 对照品溶液 20 μL，进样 6 次，记录色谱峰的 tR。结果葡聚糖T110 的平均 tR为 10.50 min，RSD 为 0.84% （n ＝ 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：吸取PK－F1 供试品溶液适量，于室温下 0，2，4，6，8，10，12 h 时进样分析，记录样品的 tR。结果PK－F1 供试品溶液的平均 tR为 10.47 min，RSD为 1.42%（n ＝6），表明方法稳定性良好。

重复性试验：取PK－F1 供试品适量，精密称定，共6 份，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录样品的 tR。结果PK－F1 的平均 tR为10.51min，RSD 为 0.86%（n ＝ 6），表明方法重复性良好。

检测限确定：按葡萄糖的3 倍基线噪音值计算，按2.1 项下色谱条件测定。结果检测限为 0.021 μg ／mL。

2.4 样品含量测定

吸取2.2 项下供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定 tR，计算分子量。结果见图1。PK－F1 和PK－F2 的主峰相似，其中，P1 的 tR为 10.55 min，Mw 为 145 850；P2的 tR为 12.78 min，Mw 为 24 565。PK －F3 中 P3 的 tR为 16.91 min，Mw 为 907。

图1 高效分子排阻色谱图1.P1 2.P2 3. P3A. PK －F1 test solution B.PK －F2 test solution C.PK －F3 test solutionFig.1 HPSEC chromatograms

3 讨论

黄精多糖为黄精的主要有效成分，现知已有结构为葡萄糖单元为主的多糖聚合物，其结构复杂，类型多样，对其质量分析方法有待深入研究。分子量是多糖重要的特征性参数，本研究中采用系列分子量的葡聚糖为对照，分别测定了3 个滇黄精多糖醇沉物样品的 Mw，由2.4 项下样品含量测定可知，PK －F1 的 Mw 为 14 5850，未见相关文献报道，其结构需做进一步分析。

黄精多糖作为滇黄精的主要有效成分，为滇黄精质量评定的重要指标。本试验中通过HPSEC 法，测定了滇黄精多糖的分子量，为进一步探讨其结构提供了参考。本方法简易快速，准确度高，重复性好，为滇黄精分子量测定的有效方法。