一株嗜水气单胞菌噬菌体的分离鉴定与生物学特性

高绪娜， 李金敏， 桑瑞新，丁庆华， 徐海燕

（1.山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东省动物微生态制剂重点实验室，山东泰安271000；2.山东省畜产品质量安全中心，山东济南250000）

嗜水气单胞菌是一种革兰氏阴性条件致病菌，广泛存在于淡水、污水、土壤及人体粪便中（潘吉脉等，2019），是我国流行最广泛的典型“人-畜-水生动物”共患病病原菌（Beaz-Hidalgo，2013）。鱼感染该菌后，鳃部、体表出血溃烂，内脏发白，可引起急性肠胃炎等症状，由嗜水气单胞菌引发水生动物的病例不断增加，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌（陆承平，2013）。该菌对水产养殖业和人类健康造成严重威胁（姜艳丽等，2015）。目前，我国对于嗜水气单胞菌病害的防治主要采用抗生素，长期使用不仅破坏机体胃肠道微生态平衡、干扰免疫系统、降低疾病的抵抗力，而且造成药物残留及耐药菌株的出现，已经严重威胁到消费者健康，欧盟等国家已经禁止使用抗生素预防水产动物嗜水气单胞菌，因而亟需寻找新的生态友好型抗菌剂。

近年来，噬菌体作为抗生素替代品在防治细菌性疾病方面的研究得到广泛关注（Marion等，2014；Benjamin等，2013）。噬菌体又称细菌病毒，能够特异性的感染和杀死细菌，附着于宿主，并通过内部复制和裂解细菌将自身释放到环境，从而将细菌杀死（冀亚路等，2020；李跃，2014）。江艳华等（2020）研究发现，副溶血性弧菌裂解性噬菌体VpJYP2能显著降低生三文鱼片中副溶血性弧菌数，且噬菌体浓度越高，抑菌效果越显著；仇笑笑（2020）研究发现，沙门氏菌噬菌体CR5对沙门氏菌具有良好的抑菌效果；许东勤（2018）研究发现，噬菌体SLMP1浓度为108PFU/g时对沙门氏菌抑制效果最显著；Yang等（2019）发现一组具有广谱抑菌作用的鸡尾酒噬菌体，并将其应用于冷冻斑点叉尾鮰，得出其具有较好的抑菌效果。

目前利用噬菌体治疗嗜水气单胞菌相关疾病优势明显，但成熟的应用研究还相对较少。本试验以嗜水气单胞菌为研究对象，从鲤鱼内脏样品中分离噬菌体并进行生物学特性及杀菌效果研究，以期为嗜水气单胞菌噬菌体的研究和后续的治疗防控提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 嗜水气单胞菌CVCC-4002，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 主要试剂和仪器 TSA培养基、TSB培养基，购自青岛高科园海博生物科技有限公司；Tris-HCl缓冲液，购自Solarbio公司；PEG8000，购自长春市天佳生物技术有限公司；0.22μm水系微孔滤膜，购自Pall公司；巴氏吸管，购自上海晶安生物科技有限公司；恒温摇床，购自上海智城分析仪器制造有限公司；铜网，购自中镜科仪膜科技有限公司；恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；高速离心机，购自Eppendorf公司；透射电镜，购自日本日立公司；生物安全柜，购自苏净安泰空气技术有限公司。

1.3 噬菌体的分离 采自泰安五马市场的鲤鱼内脏样品中加入50 mmol/mL的Tris-HCl缓冲液。30℃静置培养过夜后，4℃、8000 r/min离心10 min，吸出上清液再次离心，重复离心3次。离心后的上清液用0.22μm滤器过滤，所有滤液备用。将30℃、180 r/min培养至对数生长期的嗜水气单胞菌取300μL与300μL的滤液混合，置于恒温培养箱中30℃孵育15 min，将混合液一并加入3 mL 45℃左右的TSB半固体培养基中，混匀后倒入TSA平板中，室温放置30 min后放入恒温培养箱中30℃培养过夜。次日观察有无噬菌斑形成。

1.4 噬菌体的纯化 将出现噬菌斑的TSA平板用巴氏吸管挑取单个噬菌斑，加入生长至对数生长期的嗜水气单胞菌，30℃混合培养3 h，离心取上清，连续梯度稀释，双层平板培养。待双层平板培养长出噬菌斑后，挑取单个噬菌斑，继续梯度稀释双平板培养，如此重复5～6次，获得纯化的噬菌体。

1.5 噬菌体的电镜观察 将噬菌体液用PEG 8000沉降制备噬菌体颗粒浓缩液（许东勤，2018），取10μL浓缩液超速离心后的噬菌体样品滴加到铜网上吸附10 min，小心地用滤纸吸除噬菌体溶液。滴加5μL的2%磷钨酸溶液，染色10 min后吸除染液，室温晾干后用透射电镜观察。

1.6 噬菌体的生物学特性分析

1.6.1 宿主谱测定 对除了嗜水气单胞菌CVCC-4002之外的其他6株嗜水气单胞菌、1株维氏气单胞菌和1株溶藻弧菌进行宿主谱测定。将8株细菌于30℃、180 r/min培养过夜，取100μL菌液与100μL噬菌体混匀后，30℃培养15 min后双层平板法过夜培养，观察有无噬菌斑的形成。

1.6.2 最佳感染复数测定 （MOI） 参照Li等（2019）的方法略有调整。将过夜复苏好的宿主菌液重新接到10 mL液体TSB培养基中（1:100）培养至对数前期（OD600值为0.2～0.4）。将不同稀释浓度的噬菌体按照不同的感染复数 （MOI=0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1）与等体积的对数前期的菌液进行混合，30℃、180 r/min培养10 min后，8000 r/min离心5 min，将沉淀重悬后加入到10 mL TSB液体中，30℃、180 r/min培养3.5 h后8000 r/min离心10 min收集噬菌体上清液，0.22μm滤器过滤稀释成不同的浓度与宿主菌混合后双层平板法培养，次日计算噬菌体效价。重复3次，计算平均值。

1.6.3 一步生长曲线测定 一步生长曲线的测定参照Pajunen等（2000）方法，略有调整。将过夜复苏好的宿主菌液重新接到100 mL TSB液体中，30℃、180 r/min振荡培养至对数前期（OD600值为0.2～0.4），按最佳感染复数加入噬菌体混匀后，30℃、180 r/min继续振荡培养，每隔20 min取样进行双层平板测效价，连续取至120 min。平行重复3次，计算平均值。

1.6.4 热稳定性测定 各取1 mL噬菌体（109PFU/mL）分别于30、40、50、60、70、80℃和90℃中孵育1 h后进行双层平板测效价，每组重复3次。1.6.5 不同pH对噬菌体活性影响的测定 将噬菌体（109PFU/mL）按体积比1:9分别添加到pH为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和11.0的Tris-HCl缓冲液中，30℃温育1 h后进行双层平板测效价，每组重复3次。

1.6.6 噬菌体体外杀菌效果测定 将新鲜嗜水气单胞菌CVCC4002菌液（用0.05 M的Tris-HCL缓冲液稀释成1×106cfu/mL）与噬菌体分别以104、105、106、107PFU/mL浓度（用0.05 M的Tris-HCL缓冲液稀释）按1:9比例均匀混合后，30℃水浴5、10、30、60、180 min。同时设置阴性对照（0.05 M的Tris-HCL缓冲液代替噬菌体溶液）和空白对照（0.05 M的Tris-HCL缓冲液代替菌液和噬菌体液），每个重复3次。采用平板菌落计数法进行活菌计数，30℃培养过夜，计算杀菌率及杀灭指数。

消毒t时的杀菌率（Pt）=[（n0-nt）/n0]×100%；

杀灭指数（KI）=n0/nt；

式中：n0为阴性对照组活菌数，nt为试验组活菌数。

2 结果与分析

2.1 噬菌体的分离及纯化 通过双层平板法分离得到一株嗜水气单胞菌噬菌体，命名为BLCC16-001。对BLCC16-001反复纯化，得到纯化后的噬菌体，噬菌斑直径大小为0.5～1 mm，呈圆形空斑，无晕环。

2.2 噬菌体的电镜观察 通过PEG8000浓缩和超速离心后噬菌体BLCC16-001效价可达到2.0×1010PFU/mL。在透射电镜下观察发现，该噬菌体头部呈正多面体结构，有尾部，头部直径约60 nm，尾部长约140 nm，应属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）。电镜结果如图1所示。

图1 噬菌体BLCC16-001的电镜照片（200000×）

2.3 噬菌体的生物学特性分析

2.3.1 宿主谱测定 对除了嗜水气单胞菌CVCC-4002之外的其他6株嗜水气单胞菌、1株维氏气单胞菌和1株溶藻弧菌进行宿主谱测定发现，除了CVCC-4002，噬菌体BLCC16-001还能裂解C8-0084、C8-0085、C8-0086和C8-0087这四株嗜水气单胞菌。结果见表1。

表1 噬菌体BLCC16-001噬菌谱

2.3.2 最佳感染复数（MOI）测定 双层平板培养计效价后发现，感染复数为1、0.1、0.01、0.001和0.00001时噬菌体效价为109PFU/mL，而且0.0001感染比例下噬菌体效价达到2.4×1010PFU/mL为最佳，因此0.0001为最佳感染复数。结果见表2。

表2 噬菌体BLCC16-001最佳感染复数测定

2.3.3 一步生长曲线测定 通过一步生长曲线测定发现，噬菌体BLCC16-001的潜伏期为20 min，之后噬菌体数量开始快速增长，120 min达到1010PFU/mL，进入平台期，爆发量约为1000 PFU/cell。其结果见图2。

图2 噬菌体BLCC16-001一步生长曲线

裂解量=爆发末期噬菌体效价（2.0×1010PFU/mL）/初期宿主菌浓度（2.0×107cfu/mL）。

2.3.4 热稳定性测定 对不同温度的噬菌体进行双层平板效价测定，结果显示，在低于60℃时噬菌体效价没有变化，保持恒定；当温度高于70℃时效价开始急剧下降（效价下降90%），80℃基本失活（效价下降99%），90℃时完全失活。表明该噬菌体对温度有一定的耐受性（小于60℃），但是高温也能使其迅速失活。结果见图3。

图3 噬菌体BLCC16-001热稳定性

2.3.5 不同pH对噬菌体活性影响的测定 由图4可知，噬菌体BLCC16-001具有较宽的pH耐受范围，在pH 4.0～10.0时噬菌体活性保持稳定，超过这个范围噬菌体效价开始下降，在pH 1.0和11.0时噬菌体能够彻底失活，而在1.0＜pH＜4.0的酸性环境中下降相对缓慢，有一定耐受性。

图4 噬菌体BLCC16-001 pH稳定性

2.3.6 噬菌体体外杀菌效果的测定 由表3可知，当病原菌浓度为1×106cfu/mL时，噬菌体BLCC16-001在浓度为106PFU/mL和107PFU/mL，5 min内对病源菌的杀灭指数达3个数量级以上；噬菌体BLCC16-001在浓度为105PFU/mL时，3 h杀菌率达到99.2%，杀灭指数2个数量级；噬菌体BLCC16-001在浓度为104PFU/mL时，3 h杀菌率达到91.0%。

表3 噬菌体BLCC16-001杀菌率试验

3 讨论

目前养殖过程中，抗生素治疗面临巨大挑战，其效果越来越不明显，寻找新的抗菌制剂已刻不容缓。噬菌体正逐步成为一种新型的治疗方法，成为抵御细菌感染的利器（朱育玮，2015；张娜等，2011）。噬菌体控制细菌感染具有诸多优势，如噬菌体裂解细菌有高度的专一性和特异性；与抗生素相比，不易产生耐药性；安全性高，是人和动物的共生体；个体微小，增殖能力强；分布广泛，易筛选易获得等（陶程琳等，2020）。

本研究从山东泰安五马市场的鲤鱼内脏中分离到了一株嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001，经透射电镜观察发现其头部呈正多面体结构，有尾部，头部直径约60 nm，尾长约140 nm。按国际病毒分类委员会分类标准，该噬菌体应属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）的烈性噬菌体。与沈婵娟（2013）分离得到的嗜水气单胞菌噬菌体结构一致。

对噬菌体BLCC16-001进行一系列生物学特性分析，试验结果表明，该噬菌体能够耐受60℃以下的温度，超过70℃会急剧失活，相比于曹永生等（2019）分离的噬菌体pAhMJG其耐热性较强。该噬菌体对酸碱均具有一定的抵抗力，在pH为4.0～10.0时稳定，其酸耐受性要强于噬菌体CC2和噬菌体9-1（沈婵娟，2013）；碱耐受性要强于噬菌体G65和噬菌体Y71（高珊珊，2016）。表明噬菌体BLCC16-001具有良好热稳定性及酸碱耐受性，有助于在生产、加工及应用过程中保持良好的活性。

一般情况下，将潜伏期短、裂解量高的噬菌体，视为毒力较高，且这类噬菌体更易获得，是实践应用中的理想噬菌体（王志丽，2012）。噬菌体BLCC16-001潜伏期20 min，爆发量1000 PFU/cell，发酵平台期滴度约达到1010PFU/mL，远高于噬菌体CC2和噬菌体9-1（沈婵娟，2013）及王志丽（2012）等研究报道的中华鳖源嗜水气单胞菌噬菌体。感染复数是研究病毒感染和产出之间量效关系的一个重要的生物学指标（Stenholm等，2008）。最佳感染复数较低的噬菌体对宿主细胞具有更高的感染率，噬菌体BLCC16-001最佳感染复数为0.0001，低于噬菌体株N21、W3、G65、Y71和Y81的最适感染比，分别为0.01、1、0.001、0.1和0.001（高珊珊，2016）。也有文献报道感染复数在一定程度上决定了噬菌体疗法的最终效果。噬菌体BLCC16-001在感染复数为0.1时，3 h对宿主菌杀菌率超过90%，感染复数为1时，3 h对宿主菌杀菌率超99%。使用浓度低于噬菌体AhyVDH1，感染复数为10时，宿主菌的数量控制到较低值（肖炜，2020）。

总之，目前都在积极寻找抗生素的替代品，如益生菌、植物提取物和噬菌体等，其中噬菌体裂解细菌有高度的专一性和特异性，是一种很有潜力的抗生素替代品（葛志毅等，2020）。目前关于嗜水气单胞菌噬菌体的研究有限，相信在不久的将来，噬菌体凭借其独特的优势，会成为治疗嗜水气单胞菌相关疾病的另一条有效途径。为了克服单个噬菌体治疗有可能导致耐药菌株出现的局限性，有必要分离更多的噬菌体，构建噬菌体库，采用混合噬菌体疗法。

4 结论

本研究从鲤鱼内脏分离到一株嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001，通过电镜形态观察，该噬菌体属于肌尾噬菌体科（Myoviridae）的烈性噬菌体。噬菌体BLCC16-001热稳定性及酸碱耐受性表现良好，最佳感染复数低、裂解量高，且在浓度为106PFU/mL和107PFU/mL，5 min内对病源菌的杀灭指数达3个数量级以上。