超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取绞股蓝总黄酮工艺研究

玉 澜， 龙海华， 唐 森，2， 谢济运， 张 鹏，2*

（1.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西来宾546199；2.广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室，广西来宾546199；3.广西科技师范学院实验实训中心，广西来宾546199）

绞股蓝又名天堂草、七叶胆、五叶参和七叶参等，在广西来宾金秀县有广泛的分布（常拓等，2019；鲍凤霞等，2018）。因其具有健胃、消炎、抑菌、杀菌等作用，成为当地瑶族人民广泛使用的中药材，也可用作动物饲料添加剂。研究表明，绞股蓝植物中主要化学成分包括皂苷、多糖、维生素、无机元素和黄酮类化合物等，其中活性成分黄酮类化合物与动物的内分泌、脂质代谢及抗氧化有着密切关系，在促进动物生产性能及提高免疫力等方面起着重要作用（王广慧等，2020；王瑞等，2014）。因此，绞股蓝具有巨大的研究和开发潜力。

目前，提取总黄酮的方法有传统回流提取、微波辅助提取和酶法辅助提取等。传统回流提取耗时长，杂质多；微波辅助提取温度高，溶剂损失大，影响试验结果；酶法提取需要使用专一性的酶，价格贵，提取成本高（裴炜等，2014）。为提高提取效果，本试验采取一种新型的液-液萃取分离技术——双水相萃取，双水相萃取是两种聚合物在适当的浓度、温度下混合在一起形成的一种高效绿色生物分离技术，具有传质快、分相时间短、选择性高和萃取条件温和等优势，能除去大量可溶性杂质，且对人体无害（辜鹏，2008）。本研究采用的乙醇-硫酸铵双水相体系，具有低廉、低度、体系简单及后续处理容易等优点（张喜峰等，2013）。同时采用超声辅助提取，利于细胞中的成分进入溶剂中，加速细胞成分与溶剂的相互渗透和溶解，从而提高黄酮类化合物在溶剂中的溶解速度（曹小燕等，2019）。本研究为高效提取天然药用植物中的黄酮类化合物提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 绞股蓝，古都养生堂药店；芦丁标准品（HPLC≥95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸铵、95%乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠均为分析纯，西陇科学股份有限公司。

1.2 仪器与设备 电子分析天平（JY3002），上海良平仪器有限公司；中草药粉碎机（FW-135），天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（GZX-GF101-3-S），上海沪粤明科学仪器有限公司；数控超声波清洗器（KQ-300DB），昆山市超声仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（型号UV-9600），北京瑞利分析仪器有限公司；循环水多用真空泵（SHZ-DⅢ），巩义市科瑞仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线绘制 根据张喜峰等（2013）方法绘制芦丁标准曲线，得到线性回归方程为：Y=10.7188X＋0.0378，R2=0.9992。

1.3.2 样品制备及总黄酮含量的测定 绞股蓝药材除杂后置于60℃恒温干燥箱中干燥24 h，粉碎后过60目标准筛，用封口袋密封备用。准确称量预处理过的绞股蓝粉末2.00 g，加入到按照一定料液比加入不同浓度的乙醇水溶液和适量硫酸铵配制成的双水相体系中，放入到一定温度、功率的超声波清洗器中提取一定时间之后取出，进行减压抽滤，收集滤液至分液漏斗中，静置，收集上清液于烧杯中，准确量取一定体积的上清液于50 mL容量瓶中，根据芦丁标准曲线绘制方法测定上清液的总黄酮浓度，超声波辅助双水相提取绞股蓝总黄酮的提取量计算公式为：

式中：C为供试品中绞股蓝总黄酮浓度，mg/mL；V为上清液体积，mL；N为稀释倍数；M为绞股蓝质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对绞股蓝总黄酮提取量的影响 固定乙醇浓度为40%，硫酸铵的用量0.2 g/mL分别配制成料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60（g/mL）稳定的双水相体系，加入称取的绞股蓝粉末2.00 g，置于超声功率为240 W，超声温度50℃的超声波清洗器中，水浴超声30 min。由图1可知，绞股蓝黄酮提取量随着料液比的增大呈现先上升后缓慢下降的趋势。当料液比为1：30（g/mL）时，绞股蓝总黄酮提取量最大。原因是随着提取溶剂增多，增大了绞股蓝粉末与提取液的接触面积，促进了黄酮的溶出（李琪等，2011）。继续增加提取液，绞股蓝粉末的溶出达到饱和或者绞股蓝中一些醇溶性杂质竞争性溶出促使黄酮提取量下降且变化缓慢。且当料液比过大会造成溶剂和盐溶液使用量增加，实际生产成本增加，也不利于后期的回收和利用。因此，选择料液比为1：30（g/mL）进行考察。

图1 料液比对黄酮提取量的影响

2.1.2 乙醇浓度对绞股蓝总黄酮提取量的影响固定料液比1:30（g/mL），分别用浓度为35%、40%、45%、50%、55%的乙醇溶液与硫酸铵配制成稳定的双水相体系，硫酸铵用量固定为0.2 g/mL，加入绞股蓝粉末2.00 g，置于超声功率为240 W，超声温度为50℃的超声波清洗器中，水浴超声30 min。由图2可知，在乙醇浓度达到50%之前，绞股蓝总黄酮提取量随着乙醇浓度的增加而逐渐增加，而当乙醇浓度为50%，绞股蓝总黄酮提取量达到极值，继续增大乙醇的浓度。绞股蓝总黄酮提取量逐渐下降。原因是硫酸铵的初始质量分数相同时，乙醇质量分数增大，分相能力也就增大，上相中乙醇质量分数也就随之增加，黄酮在乙醇中的溶解度比水中大得多。而且当乙醇浓度较小时，溶剂的极性较高；随着乙醇浓度的增加，溶剂的极性逐渐降低，因此总黄酮提取量随之增加（李建凤等，2020），当乙醇浓度大于50%时，硫酸铵开始饱和析出，影响总黄酮的浸出，且此时溶剂的极性过低，从而导致总黄酮提取量开始降低，结合双水相体系的稳定性，选择乙醇浓度为50%的双水相体系进行考察。

图2 乙醇浓度对黄酮提取量的影响

2.1.3 硫酸铵用量对绞股蓝总黄酮提取量的影响固定料液比1:30（g/mL），用浓度为50%乙醇溶液与硫酸铵分别配制硫酸铵用量为0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/mL稳定的双水相体系，加入绞股蓝粉末2.00 g，置于超声功率为240 W，超声温度为50℃的超声波清洗器中，水浴超声30 min。由图3可知，随着硫酸铵用量的增大绞股蓝总黄酮的提取量呈现先增加后减少的趋势，当硫酸铵用量为0.25 g/mL时，提取量达到最大值。原因是硫酸铵的用量可以改变两相在双水相中体积分布，从而影响乙醇相中的分配。开始增大硫酸铵的用量时，硫酸铵与乙醇溶液中水分快速结合形成双水相中的下相，使得乙醇相中的乙醇浓度增大。当硫酸铵的用量过大，硫酸铵水溶液达到饱和，两相中的乙醇相体积过少，并伴有硫酸铵析出，从而使总黄酮提取量下降（林金清等，2004）。因此，选择硫酸铵用量为0.25 g/mL为最佳。

图3 硫酸铵用量对黄酮提取量的影响

2.1.4 超声功率对绞股蓝总黄酮提取量的影响固定料液比1:30（g/mL），用浓度为50%乙醇溶液与硫酸铵配制成硫酸铵用量为0.25 g/mL稳定的双水相体系，加入绞股蓝粉末2.00 g，分别置于超声功率为180、210、240、270、300 W，超声温度为50℃的超声波清洗器中，水浴超声30 min。由图4可知，当其他条件不变的情况下，绞股蓝总黄酮的提取量随着超声功率的变化而变化，超声功率为240 W时提取量达最大值，继续加大超声功率，总黄酮提取量逐渐下降。原因是当增加超声功率加速了绞股蓝粉末在提取液中运动，从而增加黄酮的溶出，继续增大超声功率时，可能由于超声波功率效应促使黄酮类成分发生降解、聚合等反应，使黄酮类提取量下降（玉澜等，2014）。因此，超声功率选择240 W为宜。

图4 超声功率对黄酮提取量的影响

2.1.5 超声时间对绞股蓝总黄酮提取量的影响固定料液比1:30（g/mL），用浓度为50%乙醇溶液与硫酸铵配制成硫酸铵用量为0.25 g/mL稳定的双水相体系，加入称取的绞股蓝粉末2.00 g，置于超声功率为240 W，超声温度为50℃超声波清洗器中，分别水浴超声10、20、30、40、50 min。由图5可知，当其他条件不变的情况下，绞股蓝总黄酮提取量随着超声时间的增加，先上升再稳定在一定水平后下降，当超声时间为20～40 min时，总黄酮提取量稳定在12.52～12.92 g/mg，继续增大超声时间，绞股蓝总黄酮的提取量下降，原因是继续增大超声时间，绞股蓝中的皂苷类物质溶出，使黄酮类物质在上相的溶出量减少，下相的溶出量增多，从而降低总黄酮的提取量（王青豪等，2012）。因此，提取时间40 min为宜。

图5 超声时间对黄酮提取量的影响

2.1.6 超声温度对绞股蓝总黄酮提取量的影响固定料液比1:30（g/mL），用浓度为50%乙醇溶液与硫酸铵配制成硫酸铵用量为0.25 g/mL稳定的双水相体系，加入称取的绞股蓝粉末2.00 g，分别置于超声温度为40、50、60、70、80℃，超声功率为240 W的超声波清洗器中，水浴超声时间40 min。由图6可知，在提取温度较低情况下，提高超声温度对总黄酮提取量的影响不大，当超声温度达到50℃之后，对总黄酮提取量影响较大，超声温度为50～70℃，总黄酮提取量随着温度的升高而增加，当超声温度为70℃时，提取量达到极值，再继续增大超声温度，总黄酮提取量下降。原因是由于温度过高，使部分黄酮发生分解、氧化等反应，总黄酮提取量降低。因此，最佳提取温度为70℃。

图6 超声温度对黄酮提取量的影响

2.2 正交试验 通过单因素试验结果可知，超声时间在20～40 min，黄酮的提取量都比较稳定，因此固定超声时间为40 min，选取料液比、乙醇浓度、硫酸铵用量、超声功率、超声温度5个因素对绞股蓝总黄酮提取量进行正交试验设计，正交试验设计因素及水平见表1。

表1 因素与水平

2.2.1 正交试验结果及分析 根据正交试验设计对料液比、乙醇浓度、硫酸铵浓度、超声功率、超声温度进行5因素4水平L16（45）正交试验，经过公式运算，得出正交设计结果（表2）。

表2 正交试验结果分析

由正交试验结果极差分析可知，料液比（A）、乙醇浓度（B）、硫酸铵用量（C）、超声功率（D）和超声温度（D）对绞股蓝总黄酮提取量都有一定的影响，其中影响大小的次序为：料液比＞乙醇浓度＞硫酸铵用量＞超声功率＞超声温度。最优的提取工艺为A2B3C2D2E3，即料液比为1:30（g/mL），乙醇浓度为50%，硫酸铵用量为0.25 g/mL，超声功率为240 W，超声温度为70℃。

2.2.2 验证试验 通过单因素试验和正交试验结果分析，选取料液比为1:30（g/mL），乙醇浓度为50%，硫酸铵用量为0.25 g/mL，超声功率为240 W，超声时间为40 min，超声温度为70℃，做最优水平搭配验证试验，进行3组平行试验得到总黄酮平均提取量为15.90 mg/g。

3 结论

本试验通过超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取绞股蓝中的总黄酮，以总黄酮的提取量为评价指标，经过单因素试验并结合正交试验得到最佳提取工艺为：料液比1：30（g/mL），乙醇浓度50%，硫酸铵用量0.25 g/mL，超声提取功率240 W，超声提取时间40 min，超声提取温度70℃。在此条件下，总黄酮提取量最高为15.90 mg/g。