一例猪源致病性大肠杆菌的分离鉴定

黄显晔　谢宇庭　张鹏宇

摘要：黑龙江省大庆市某猪场发生了仔猪腹泻的情况。为了探究是何种病原微生物造成的仔猪腹泻，对病死仔猪进行剖检，并无菌采集剖检病料进行镜检、病原菌分离培养、PCR确定该病原菌携带的毒力基因，并进行了药敏试验。结果显示，引起该猪场仔猪腹泻的病原菌为产肠毒素性大肠杆菌，携带F5黏附素菌毛。该株大肠杆菌对头孢噻呋、头孢曲松敏感。对恩诺沙星、环丙沙星及四环素耐药。

关键词：仔猪;腹泻;大肠杆菌;黏附素;生化实验;药敏试验

中图分类号：S858.28        文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2021）04-0008-02

大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌。起初被认为是人类及动物体内的常在菌群，但科研人员逐渐发现，某些血清型的大肠杆菌会引起人及动物的某些疾病。其中，大肠杆菌可以引起仔猪黄痢、仔猪白痢以及水肿病等[1]。致病性大肠杆菌可分为多种，包括肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAggEC）及肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）。一般通过对致病性大肠杆菌进行毒力因子检测可确定其为何种类型。目前确定致病性大肠杆菌毒力因子的方法主要有黏菌素菌毛、肠毒素以及LEE毒力岛素等[2]。确定为何种致病性大肠杆菌后，可通过药敏试验筛选高敏感药物，为治疗该病提供帮助。

2020年10月，黑龙江省大庆市某猪场发生了仔猪腹泻。从该猪场送检器官中分离出一株致病性大肠杆菌，用PCR法对该株细菌所含有毒力因子进行了检测。并对其进行了药敏试验，旨在为该猪场治疗仔猪腹泻提供依据。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 无菌采集来自黑龙江省大庆地区某猪场死亡仔猪的病料，包括小肠、大肠、肝脏以及脾脏等。

1.1.2 试剂与仪器 伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、MH琼脂培养基，青岛海博生物技术有限公司;50×TAE，上海碧云天生物技术有限公司;革兰氏染色液，郑州理利生物工程有限公司;药敏纸片、生化试验管，杭州滨和微生物试剂有限公司;Taq Master Mix、DNA Marker，大连Takara公司;Bio-Rad梯度PCR仪，伯乐生命医学产品有限公司。

1.1.3 试验动物 清洁级昆明雌鼠6只，35日龄，体重20～26 g，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原分离培养 取病死仔猪的的小肠、大肠、肝脏以及脾脏接种于麦康凯和伊红美兰琼脂平板上。在37 ℃条件下培养12  h，再挑取形态特征明显的单菌落，划线传代培养，连续培养3代后挑取单菌落进行革兰氏染色，显微镜观察细菌形态。

1.2.2 动物致病性试验 试验小鼠分为试验组和对照组，每组3只。小鼠在试验前适应环境1周。试验前12 h禁食、禁水。根据相关文献[3]，将分离菌种进行培养，并对试验组小鼠进行腹腔注射，注射量为1×109 CFU/只。对照组注射无菌生理盐水。

1.2.3 毒力因子测定 根据相关参考文献[4，5]的引物序列设计F4、F5以及987P毒力基因引物（表1）。取纯培养的细菌菌液1.5 mL，100 ℃水浴15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清为细菌DNA模板进行毒力因子的测定

1.2.4 药敏试验 按照CLSI的指导进行药敏试验，试验用药敏纸片包括头孢曲松、头孢噻呋、恩诺沙星、环丙沙星及四环素等。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与纯化

将病死仔猪的器官进行镜检，观察到革兰氏阴性短杆菌。对分离出来的细菌接种到伊红美蓝及麦康凯培养基上。在伊红美蓝培养基上观察到带金属光泽的菌落，在麦康凯培养基上观察到粉色的菌落。结合生化试验结果，确定该菌为大肠杆菌。

2.2 动物致病性试验

试验组小鼠在注射后2 h观察到精神萎靡的现象，4 h开始腹泻，8 h后全部死亡。对照组小鼠健康，无死亡。对试验组小鼠进行心血涂片，可以观察到革兰氏阴性短杆菌。复涂于伊红美蓝培养基，观察到带金属光泽的菌落，判定检测出的大肠杆菌为致病性大肠杆菌。

2.3 毒力基因鉴定

对分离出的致病性大肠杆菌进行毒力基因检测，从而确定其携带的毒力因子。经过PCR测定后，发现该株细菌携带F5黏附素菌毛（图1）。由此确定该株细菌为产肠毒素性大肠杆菌。

2.4 药敏试验结果

将分离菌株进行药敏试验，抑菌环与CLSI相关文件进行比对，发现该株细菌对头孢噻呋、头孢曲松敏感。对恩诺沙星、环丙沙星及四環素耐药。

3 小结与讨论

致病性大肠杆菌可以引起多种动物疾病，包括仔猪腹泻及犊牛腹泻。其中产肠毒素性大肠杆菌为常见的菌种。目前较为常见的方式就是通过PCR方法对大肠杆菌进行毒力因子检测，从而确定为何种类型的致病性大肠杆菌[6]。产肠毒素性大肠杆菌对动物造成疾病的机制与黏附素性菌毛以及肠毒素相关。产肠毒素性大肠杆菌进入动物机体后，通过黏附素菌毛与特异性受体结合后释放肠毒素，导致正常的代谢破坏，从而导致腹泻[7]。常见的黏附素菌毛包括F4菌毛（又称为K88菌毛）、F5菌毛（又称为K99菌毛）、987P菌毛、F17菌毛及F41菌毛等。其中F4、F5及987P菌毛为猪源性产肠毒素性大肠杆菌常携带的菌毛[8]。经常检测这几种菌毛可为猪源性大肠杆菌进行定型。本次试验分离得到的致病性大肠杆菌检测出了F5黏附素菌毛，从而确定为产肠毒素性大肠杆菌，了解了其致病机制，为其防治提供了理论依据。

利用药敏试验可以为临床用药治疗疾病提供依据。本次药敏试验得出该株大肠杆菌对头孢噻呋、头孢曲松敏感，对恩诺沙星、环丙沙星及四环素耐药。可以看出该株细菌对头孢菌素类抗生素敏感，但是对喹诺酮类药物及四环素耐药。这种现象的产生可能与这两种药物在猪场使用多年有关，这使得细菌的耐药性增加[9]。并且细菌间耐药性的传播也可以通过质粒完成，这也使得细菌耐药性传播速度加快。在此情况下，猪场可以通过药敏试验筛选出对治疗有效的药物，以更好地治疗疾病。也可以根据药敏试验结果进行药物联用治疗，以抑制细菌耐藥性的产生[10]。

本试验从猪场病死仔猪体内分离出了致病性大肠杆菌，通过PCR毒力基因检测及药敏试验，确定了该株细菌的分型以及对何种药物敏感，为治疗该细菌引起的仔猪腹泻提供了技术支持。

参考文献：

[1] 石大丽. 广西部分地区猪源大肠杆菌分型及耐药性分析[D]. 南宁： 广西大学，2019.

[2] 宋美英. 致病性牛源大肠杆菌毒力基因分子流行病学调查和耐药突变选择窗的应用[D]. 哈尔滨： 东北农业大学，2017.

[3] 张 震，宋美英，只 勇，等. 黑龙江省部分牛场致病性大肠杆菌毒力因子的调查与分析[J]. 黑龙江畜牧兽医，2017（2）： 160-166.

[4] ZHANG W，ZHAO M，RUESCH L，et al. Prevalence of virulence genes in Escherichia coli strains recently isolated from young pigs with diarrhea in the US[J]. Veterinary microbiology，2007，123（13）： 145-152.

[5] 陈楠楠，史同瑞，尹珺伊，等. 齐齐哈尔地区仔猪腹泻大肠杆菌血清型与毒力基因分析[J]. 黑龙江八一农垦大学学报，2018，30（6）： 23-27.

[6] 余 佳. 猪源大肠杆菌的分离鉴定，毒力基因检测及敏感药物筛选[D]. 福州： 福建农林大学，2019.

[7] 任敏敏，徐 娥，申露露，等. 产肠毒素大肠杆菌致使仔猪腹泻致病机理的研究进展[J]. 浙江畜牧兽医，2019，5（1）： 12-17.

[8] 葛晨玲，石大丽，胡 文，等. 广西猪源产肠毒素大肠杆菌毒力因子及多重耐药性分析[J]. 中国畜牧兽医，2019，46（3）： 279-289.

[9] 王春江，赵献军，赵 宝，等. 陕西省致仔猪腹泻ETEC的分子流行病学调查[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2010，38（7）： 21-26.

[10] 刘玲红. 动物源大肠杆菌的抗药性及联合用药策略研究[D]. 山东泰安： 山东农业大学，2018.