蛋壳形成与卵钙蛋白-32的研究进展

农燕鸿　任宇　郭爱伟　李青青　吴培福　杨亚晋　陈粉粉　刘莉莉

摘要：蛋壳是由无细胞子宫液中碳酸钙和有机基质沉积而成的高度有序的结构。鸡的蛋壳由3层组成，由内向外分别是蛋白质壳膜、钙化层和角质层。钙化层提供了坚硬的保护壳，角质层不仅在调节水和气体交换方面发挥重要作用，还含有多种抗菌蛋白。卵钙蛋白-32（Ovocalyxin-32，OCX-32）是由子宫或输卵管上皮细胞分泌的一类特异性基质蛋白，主要分布在蛋壳的角质层，它通过终止钙化和抗菌保护在蛋壳形成过程中起着不可或缺的作用。文章综述了蛋壳形成过程和OCX-32在禽蛋中的来源、分布以及生物学功能等，以期为后续该蛋白质的相关研究提供参考和新的思路。

关键词：蛋壳形成;OCX-32;钙化;抗菌保护

中圖分类号：S831.1        文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2021）04-0020-04

蛋壳质量是商品蛋生产的重要特征。尽管在整个产蛋周期中产蛋的总数很重要，但每个蛋在结构上也必须牢固，且能够承受物理和微生物的挑战。家禽的蛋壳被认为是一种钙质的生物陶瓷，由于其高度复杂有序的多孔多晶结构，使自身具有独特的力学性能，不仅可以在一定程度上保护发育中的胚胎免受物理冲击，还可以调节水、氧气和二氧化碳在外部环境和胚胎间的扩散交流，是胚胎发育和生存必不可少的物质基础[1]。研究表明，蛋壳的这种多孔多晶结构与蛋壳基质蛋白有着密不可分的关系[2]。卵钙蛋白-32（Ovocalyxin-32，OCX-32）是蛋壳钙化过程中所特有的基质蛋白，可通过终止蛋壳钙化和抗菌防御等生理功能影响蛋壳的形成和胚胎的发育[3]。基于此，本文分析了蛋壳形成过程及OCX-32在禽蛋中的来源、分布及其生物学功能，为后期的深入研究奠定了基础。

1 蛋壳的形成概述

1.1 蛋壳的结构

蛋壳是在家禽子宫部形成的一种高度复杂有序的钙化结构，由约94%～97%的无机物和约3%～6%的有机物组成[4-5]。从分子水平来看，蛋壳可分为3层：非钙化层，为富含有机成分的内、外壳膜，壳膜中含有约10%的胶原蛋白（I型、V型和X型）和70%～75%的蛋白多糖;钙化层，为碳酸钙以方解石晶体形式沉淀形成的乳突层、栅栏层和垂直晶体层，含有约95%碳酸钙、3.5%有机基质蛋白以及镁、磷等各种微量元素;角质层，为处于蛋壳最外层的胶护膜，富含羟基磷灰石和多种抗菌蛋白[5-7]。

1.2 蛋壳的形成

禽蛋是在卵子从卵巢释放后沿着输卵管移动的过程中形成的，主要由蛋白、蛋壳膜、钙化蛋壳和角质层包围的中央蛋黄组成[8]。排卵后，卵子分别在输卵管漏斗部和膨大部合成卵黄质外膜和蛋白[7]，然后，蛋黄/蛋白复合体依次穿过输卵管的峡部和子宫部，完成蛋壳钙化。

钙化是鸡蛋形成过程中耗时最长的阶段，可分为三个不同的阶段：初始阶段、快速增长阶段和终止阶段[9]。蛋壳沉积的初始阶段又可分为3个小阶段，即壳膜、成核位点和乳突层的先后形成[8]。首先，输卵管近端（白色峡部）的上皮细胞分泌壳膜的各种前体蛋白（约90%）、脂质体（约3%）和少量的糖类（约2%）以构成蛋白多糖，蛋白多糖与角蛋白、胶原蛋白共同形成纤维结构蛋白并交织成网状纤维，多层纤维网再组织构成形态不同的内、外壳膜，成为方解石晶体沉积的结构基础。然后，发育中的蛋移动到输卵管远端（红色峡部），由腺体细胞分泌的卵磷脂17（Ovocleidin-17，OC-17）通过自身精氨酸残基与方解石晶体表面的钝角台阶紧密结合，进而促进多个方解石晶体在外壳膜上不连续的位置上聚集形成近似球状的有机聚合体，即成核位点[10-12];接下来，由上皮细胞分泌的卵磷脂-116（Ovocleidin-116，OC-116）发生糖基化，它与腺体细胞分泌的一种糖胺聚糖——硫酸角质素（Keratan sulphate，KS）共价结合形成以OC-116为核心蛋白的蛋白多糖，由于KS自身携带的硫酸基含有大量的阴离子，因此通过电离效应就可吸附钙离子到成核位点，促进方解石成核并迅速向外生长，最终到达栅栏层基部，形成富含蛋白多糖的乳头状突起，即乳突层，整个初始阶段持续约6 h[13]。在快速生长阶段，子宫液中的硫酸皮肤素（Dermatan sulphate，DS）和硫酸软骨素（Chondroitin sulphate，CS）同时与OC-116发生糖基化，并生成含有2种糖胺聚糖的蛋白多糖，其中CS含量较多，DS含量较少，大量的阴离子导致钙离子聚集，方解石晶体以平均沉积速率为0.33 g/h的速度进行线性沉积，该阶段持续约10 h[7，14]。乳突层和栅栏层的超微结构可以用晶体生长竞争模型来粗略解释，即方解石聚集形成成核位点时，位点最初为可以向所有方向生长的状态，当生长到一定程度时，由于相邻生长位点之间的空间竞争，只有垂直于卵黄表面生长的晶体才有空间生长，因次乳突层整体呈圆锥体状，栅栏层呈现垂直于蛋壳表面的柱状物形态[7]。柱状晶体生长一直持续到沉积了一层薄的垂直晶体层，该垂直晶体层具有比栅栏层更高密度的晶体结构。当钙化进行到最后阶段时，输卵管上皮细胞分泌大量的OCX-32使方解石停止生长，鸡蛋表面形成一层约0.5～12.8 μm的角质层，角质层通过覆盖外壳并填充其孔的入口，产生一个屏障，阻止水在蛋壳上的运动，并防止蛋内部脱水，该过程持续约1.5 h[15]。

1.3 基质成分对钙化的调节

钙化发生在一种无细胞子宫液中，其中含有可溶的基质前体和过饱和的钙和碳酸氢根离子，方解石晶体与蛋壳基质蛋白在该环境中相互作用并自发沉淀[14]。目前，在鸡身上鉴定出的蛋白数量已经从50种增加到1 300种左右，其中在蛋壳中被鉴定出来的有约900种[15]，这些蛋白质可分为3个特征组：①蛋清蛋白，也存在于蛋壳中，包括卵清蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白;②普遍存在的蛋白质，例如骨桥蛋白（一种存在于骨骼和其他硬组织中的磷酸化糖蛋白）和簇蛋白（一种分布广泛的分泌性糖蛋白）;③蛋壳钙化过程所特有的基质蛋白，是由输卵管特定区域中的细胞分泌的，包括Ovocleidins和Ovocalyxins两大类[17]。Ovocleidins主要包括OC-17、OC-116;Ovocalyxin主要包括Ovocalyxin-21（OCX-21）、Ovocalyxin-25（OCX-25）、OCX-32和Ovocalyxin-36（OCX-36）[17，18]。这些有机成分的数量及其在子宫液中的浓度随蛋壳沉积的不同阶段而变化。在每个阶段中，特定的有机成分在输卵管的特定时间和位置分泌，并沉积在蛋壳的不同结构区域形成完整蛋壳[19]。

研究发现，蛋壳基质蛋白可通过3条途径影响蛋壳的形成：①作为核心蛋白与糖胺聚糖结合形成蛋白多糖，影响方解石的形态，如OC-116作为蛋壳硫酸皮肤素蛋白聚糖（116 kDa和180 kDa）的核心蛋白，广泛分布在钙化蛋壳的栅栏层中，影响栅栏层的沉积[5];②通过蛋白磷酸化影响蛋壳结构的强度和形状，主要的磷酸化蛋白有OC-17、OC-116和OCX-32等，它们以磷酸化依赖性方式调节晶体的成核和生长，在碳酸钙（方解石）或磷酸钙（磷灰石）的形成中起着积极的作用[5];③依赖与免疫有关的特性影响蛋壳品质，如溶菌酶、卵清蛋白、卵转铁蛋白、OCX-32、OCX-36等在蛋壳形成的起始和末期发挥钙化和抗菌的双重作用[5，20]。

2 OCX-32的概述和作用机制

2.1 OCX-32的概述

OCX-32是一种由管腔上皮细胞分泌的32 ku的特异性基质蛋白，集中分布在蛋壳的外部钙化区域和角质层中[21，22]。

2.2 终止钙化

Gautron等[2]通过蛋白质印迹法发现OCX-32既不存在于血浆中，也不存在于负责蛋清蛋白产生和分泌的近端输卵管，而存在于子宫和远端输卵管（峡部），表明其并非由其他组织分泌后通过血液传输到子宫液中，而是在蛋壳钙化过程中由子宫细胞分泌。蛋壳发生钙化时，不同阶段子宫液中OCX-32的表达量随着钙化的进行逐步增多[23]。在钙化终止阶段，能明显地探测到子宫液中含有高水平的OCX-32[24]，但是，目前的研究还不能完全解释OCX-32参与钙化终止的具体机制[25]，本文将从OCX-32和方解石的特性推测可能存在的终止机制。

Hernández-hernández等[9]的体外碳酸钙沉淀试验显示子宫液和纯化的蛋壳提取物中存在的OCX-32对方解石表面具有很强的亲和力，并且在控制方解石晶体的生长或聚集中具有积极的作用。随后的研究证实了这一点，用蛋白酶K缓冲液处理的方解石晶体显示出孔洞，表明先前存在被吸附的蛋白质[26]。子宫液特定环境条件中OCX-32与方解石之间的静电相互作用，或是OCX-32蛋白中特定官能团（即-COOH）排列与特定方解石中碳酸盐或钙离子排列之间的立体化学匹配，都可使OCX-32对方解石表面具有很强的亲和力，进而被选择性地从溶液中吸附到方解石表面[27]。在钙化终止末期，子宫液中大量的OCX-32被优先吸附在方解石晶面上，使子宫液中的钙离子未能在方解石晶面上继续沉淀，OCX-32与钙离子之间的竞争关系有效地抑制了方解石的自发沉淀和晶体生长，表现出方解石生长速度减缓的现象，从而实现钙化终止[28]。

此外，还推测钙化终止与OCX-32是一种磷酸化蛋白有关[16]。在蛋壳磷蛋白鉴定的研究中，通过发生埃德曼降解反应（Edmandegradation）衍生的序列确定了OCX-32在位置257和268之间的丝氨酸和苏氨酸上被磷酸化[29]，而磷酸盐与方解石之间可通过吸附、共沉淀作用生成钙磷化合物沉淀[30]，因此，大量的OCX-32与方解石发生沉淀反应导致钙化终止。

2.3 抗菌防护

研究表明，OCX-32蛋白与两种不相关的哺乳动物蛋白（羧肽酶抑制剂Latexin和维甲酸受体应答器RARRES1）具有一定的同源性（约30%）[26]。Latexin是羧肽酶A活性的抑制剂，在大鼠大脑皮层和肥大细胞中表达，因其在巨噬细胞中高水平表达，并与其他蛋白酶抑制剂和潜在蛋白酶靶点一起被诱导，所以在炎症中起着重要的作用[31]。RARRES 1最初是从人类皮肤中分离出来，与维甲酸协同可用于治疗银屑病和抑制肿瘤[32，33]。OCX-32、latexin和RARRES 1的排列蛋白序列之间存在相应的外显子边界，这表明这两个哺乳动物蛋白与OCX-32之间存在着进化联系（即基因复制后的分化）[34，35]。为了进一步研究OCX-32的功能，Xing等[21]在大肠杆菌中将其与谷胱甘肽转硫酶（Glutathione S-transferases，GST）融合形成重组蛋白，重新折叠的GST-OCX-32显著抑制了牛羧肽酶的活性，也抑制了枯草芽孢杆菌的生长，这表明OCX-32可为鸡蛋提供抗菌保护，也间接支持了角质层是抵抗不良环境和微生物入侵的第一道屏障的观点[36]。

2.4 存在的隐性功能

除此之外，许多研究人员还对OCX-32进行了单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）检测，发现OCX-32能显著影响禽蛋的其他性状，但具体机理还有待于进一步研究探索。张丽萍等[37]将OCX-32基因多态性与昆灵鸡产蛋性状进行关联分析，发现6612A/G和6760A/T 两个位点对蛋黄重有显著影响（P<0.05），6566G/A位点对蛋白高度有显著影响（P<0.05）。Uemoto等[38]分析了OCX-32表达量与产蛋性能之间的关系，发现产蛋性能低时，OCX-32表达量高;相反，产蛋性能高时，OCX-32表达量低，这表明OCX-32与产卵率有显著相关性。李俊营等[23]研究了淮南麻黄鸡OCX-32基因与蛋品质的相关性，发现494A/C位点对蛋白高度、开产蛋质量和哈氏单位有显著影响（P<0.05）。Fulton等[33]同样对OCX-32基因多态性与蛋品质的相关性进行了分析，发现了8种商品蛋鸡的OCX-32基因存在28个SNPs位点，其中18个SNPs可改变蛋白质的氨基酸序列，对蛋壳颜色有显著影响（P<0.05）。Dunn等[39，40]对OCX-32基因多态性与乳突层性状相关性进行了2次分析，结果都表明了OCX-32基因的SNPs变化与蛋壳乳突层厚度呈显著相关（P<0.05）。

3 结语

蛋壳形成的实质是有机基质与碳酸钙晶体同时在蛋壳膜上沉积的过程。目前的研究主要集中在OCX-32對蛋壳终止钙化和抗菌防御的调节上[41]，但关于其自身三维结构和修饰机制的研究仍处于初始阶段，同时OCX-32作为一种重要的子宫液蛋白，与乳突层厚度和多种蛋品质性状如蛋壳颜色、蛋白高度和蛋黄质量显著相关，由于OCX-32主要位于蛋壳的外部，因此这种关联的机制尚不清楚，有待于进一步深入研究。

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