原发性肝癌患者癌组织NLRP3炎性小体表达状况研究

陈 维，魏 涛，杨 岚，伍小敏

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床常见的恶性肿瘤，具有发病率高、病死率高等特点，其5 a生存率仅有25%左右。HCC发病具有隐匿性，研究显示HCC能逃避机体免疫系统的监视，使得早期不容易被发现，到晚期则治疗疗效差，是目前威胁人类健康最大的恶性肿瘤之一[1,2]。核苷酸结合寡聚化结构域富含脓素亮氨酸重复序列结构域3(nucleotide-binding oligomerization domain leucine rich repeats containing pyrin domain 3, NLRP3)炎性小体是一种蛋白质复合物，能够识别各种不同的炎症刺激信号，并激活相关的炎症反应[3]。目前，有研究表明NLRP3炎性小体与细胞凋亡有一定的联系。NLRP3炎性小体的接头蛋白为凋亡相关的斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing,ASC)，主要由胱天蛋白酶招募结构域(caspase activation and recruitment domain, CARD)和脓素结构域(pyrin domin，PYD)组成。这两种蛋白主要作用是连接上游 NLRP3 和下游的 Caspase-1。上游的NLRP3过表达可以在一定程度上调节下游的Caspase-1表达，引起细胞凋亡[4]。故NLRP3炎性小体危险信号传感器可以触发和调节炎症反应[5]。NLRP3炎性小体可以通过激活蛋白gasdermin D，参与原发性胆汁性肝硬化的发生和发展[6]。NLRP3可能通过TLR4信号途径参与了原发性肝癌(primary liver cancer， PLC)的免疫过程[7]。下调波形蛋白(vimentin)/NLRP3蛋白表达可以抑制肝癌细胞凋亡，实现抑制肝癌的发展[8]。但目前关于PLC患者癌组织NLRP3炎性小体表达及其临床意义的研究尚不充分，因此本研究检测了PLC患者癌组织NLRP3炎性小体表达情况，并探讨了其临床意义，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2017年1月～2018年1月我科收治的PLC患者34例，男20例，女14例；平均年龄为(41.08±8.11)岁；所有患者均符合2000年杨秉辉编写的《原发性肝癌诊断标准》[9]。排除标准：(1)具有严重的心、肝、肾功能不全和内分泌系统疾病；(2)合并自身免疫功能缺陷性疾病；(3)合并严重的感染。另选择同期因肝胆管结石而切除的肝组织标本30例作为对照组。

1.2 肝组织NLRP3表达检测 采用免疫组织化学染色法，分别取肝癌组织和肝组织，标本脱蜡、入水、PBS冲洗，加入抗原修复液，滴加正常山羊血清封闭液，加入抗NLRP3 抗体(稀释倍数1:500，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)，使用DAB 显色试剂盒(购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)显色，复染切片后晾干，在光学显微镜(WMJ-9688，上海无陌光学仪器有限公司)下观察，并计数细胞阳性率，计数100个细胞，计算细胞阳性率(%)=阳性细胞总数/细胞总数。

1.3 肝组织NLRP3 mRNA检测 采用荧光定量 PCR 法检测肝组织相关蛋白mRNA水平，使用Trizol 提取总 RNA，在分光光度计(SPECTRONIC 200，美国Thermo公司)下测定RNA纯度和浓度，反转录合成 cDNA 链。以此链为模板，使用定量PCR仪(美国 ABI 公司)扩增，95 ℃预变性2 min；95℃保持8 s，58 ℃保持 35 s，72 ℃保持40 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因水平。β-actin：上游引物：5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’，下游引物：5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’；NLRP3：上游引物：5’-GCAGCAAACTGGAAAGGAAG-3’，下游引物：5’- CTTCTCTGATGAGGCCCAAG-3’。△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因(n)；△△Ct值=△Ct(n)-△Ct(1)；计算出2-ΔΔCt值为基因相对水平。

1.4 血清细胞因子水平检测 采用ELISA法检测血清白细胞介素-6 (interleukin- 6, IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α，上海抚生生物科技有限公司)。

1.5 肝组织NLRP3炎性小体、钙依粘连蛋白(E-cadherin)、波形蛋白和半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)蛋白表达检测 采用蛋白质印迹法，取肝癌组织，使用胰蛋白酶(美国Biosharp公司)消化，提取总蛋白，使用半干法将蛋白转移到PVDF膜，置于5%脱脂奶粉下，室温封闭2 h。先后分别滴加抗钙依粘连蛋白抗体(稀释倍数1:500，美国Santa Cruz Biotechnology公司)、抗波形蛋白 抗体(稀释倍数1:500，美国Santa Cruz Biotechnology公司)、抗半胱氨酸蛋白酶-1和羊抗鼠IgG蛋白(货号：2018630258，武汉华联科有限公司)，孵育2 h，以β-actin为内参蛋白，采用显色液显色后，行吸光度分析，计算各蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组肝组织NLRP3炎性小体表达情况 在正常对照组和肝癌组均有NLRP3炎性小体表达，但肝癌组织细胞NLRP3炎性小体阳性率为76.5%，显著高于正常对照组的23.3%(P<0.05，图1)。

图1 两组肝组织NLRP3炎性小体表达情况 (SP，400×)A：正常肝组织NLRP3炎性小体呈低表达；B：肝癌组织NLRP3炎性小体呈强阳性表达

2.2 两组肝组织NLRP3 mRNA水平比较 肝癌组织NLRP3 mRNA水平显著高于正常对照组(P<0.05，表1)。

表1 两组肝组织NLRP3 mRNA水平比较

2.3 两组外周血细胞因子水平比较肝癌患者血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著高于正常人(P<0.05，表2)。

表2 两组外周血细胞因子水平比较

2.4 两组肝组织相关蛋白表达水平比较 经免疫印记检测，正常对照组肝组织E-cadherin蛋白水平为(1.2±0.15)，显著高于肝癌组【(0.41±0.04)，P<0.05】，而Caspase-1和Vimentin蛋白水平为(0.21±0.03)和(0.42±0.06)，显著低于肝癌组【(1.49±0.12)和(1.51±0.14)，P<0.05，图2】。

图2 两组肝组织相关蛋白表达比较

3 讨论

肿瘤的侵袭及迁移是重要的恶性生物学特征。有效调控去肿瘤细胞的运动能力可有效抑制肿瘤的扩散。细胞的侵袭和迁移受到上皮间质转化(epithelial mesenchyml transition，EMT)的调节[10]。EMT是指上皮细胞能暂时丧失细胞极性获得间质细胞移动的能力。肿瘤细胞能够通过细胞极性丧失，改变自身细胞形态，与其他细胞分离[11]。EMT能力决定着肿瘤细胞的侵袭能力。肿瘤细胞EMT能力越强说明肿瘤处于活化状态，其扩散和转移的可能性也较大[12，13]。同时，通过下调细胞粘附因子E-钙粘蛋白的表达[14]，将角蛋白细胞骨架变为波形细胞骨架，促进细胞穿透胞间连接，增强细胞的侵袭能力[15]。本研究发现，相对于正常肝组，肝癌组患者癌组织波形蛋白蛋白表达显著增强，而E-钙粘蛋白表达显著降低，说明细胞间的黏附能力显著下降，肿瘤的侵袭能力增强。这可能是因为NLRP3炎性小体下游相关基因可能会影响到黏附蛋白的表达，使得细胞间的黏附能力降低，使得肿瘤的侵袭迁移能力显著增强。研究表明，NLRP3炎性小体在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用，并且其表达水平的提高可诱导胃肿瘤细胞的迁移和侵袭[16]，与本研究得出的结论相一致。

炎症反应的标志性细胞因子包括炎症因子和抑炎症因子，其中IL-6、TNF-α、IL-1是重要的促炎性细胞因子，它们主要由单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞和非免疫细胞等分泌，是炎症的重要介导物质[17,18]。目前，研究较多的促炎性细胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等；抗炎性细胞因子则包括IL-4、IL-10、IL-1等。大部分TNF-α、IL-1、IL-6由单核细胞和巨噬细胞分泌，少量由非免疫细胞分泌，是引起炎症的重要物质[18]。研究表明，NLRP3 炎性小体是主要的炎症调控元件，可以调控炎症因子的表达和分泌[19]。本研究发现，肝癌患者血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高，说明肝癌患者体内炎症反应会显著升高，这可能是因为NLRP3炎性小体激活可使caspase-1 激活进而导致促炎细胞因子 如IL-1β等的过度生成，最终导致炎症的级联扩大。

正常的凋亡是细胞的重要生理学特征，但肿瘤细胞的凋亡会受到抑制。调控肿瘤细胞的凋亡也是治疗肿瘤的重要方法之一。肿瘤的凋亡受到相关基因的调控，Caspase家族基因是常见的调控基因之一[20]。在Caspase家族中，Caspase-1是Caspase家族的启动子。当细胞接收到凋亡信号后，会激活Caspase家族中的凋亡启动子Caspase-3，并激活凋亡执行子Caspase-9，使caspase-9自身裂解产生pro-caspase-9，同时会发生反馈调节促进生成pro-caspase-3，反过来再次促进有活性的Capsase-1的产生，并引发凋亡的级联反应。

Caspase家族的Caspase-1蛋白表达与NLRP3炎性小体关系密切。NLRP3炎性小体的接头蛋白为ASC，主要由CARD和PYD组成，这两种蛋白连接主要作用是连接上游 NLRP3 和下游的 Caspase-1，上游的NLRP3过表达可以在一定程度上调节下游的Caspase-1的表达。当NLRP3过表达时，会使得下游的Caspase-1表达，启动Caspase家族的凋亡启动子，促进肿瘤细胞凋亡。本研究发现，肝癌组织caspase-1蛋白表达显著升高，说明升高的NLRP3炎性小体可以促进细胞的凋亡。这可能是因为上游的接头蛋白为ASC，后者与NLRP3结合导致链接下游的PYD减少，使得caspase-1增多。

综上所述，原发性肝癌患者癌组织NLRP3炎性小体呈现高表达，其水平上调可能会导致炎症反应并促进肝癌细胞的迁移。因此，NLRP3炎性小体或许可作为肝癌治疗调控的靶点之一。