抑制TRAF6基因表达对自身免疫性肝炎大鼠肝组织NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

刘 娜，张华敏，邓巧娟

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)为自身免疫反应引起的慢性肝炎，可引起肝纤维化的发生，而炎症因子对AIH患者肝纤维化进程有着至关重要的作用[1]。肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)是TNF超家族和Toll/IL-1受体(Toll/IL-1 receptor，TIR)超家族的重要结合蛋白，可促进促炎性细胞因子基因的转录，启动炎症级联反应[2，3]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)复合物主要由p50和p65二聚体组成，激活后转运到细胞核诱导炎性细胞因子的过度产生和释放，损伤肝脏[4]。有研究发现，TRAF6可诱导IκB激酶(IKK)复合物磷酸化，从而激活NF-κB并诱导炎症细胞因子基因的表达[5]。本研究通过建立AIH大鼠模型并干扰肝组织TRAF6表达，以探讨抑制TRAF6基因表达对AIH大鼠肝脏炎症水平和NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 雄性SD大鼠60只，4～6周龄，体质量为180～220 g，购自中国科学院昆明动物研究所【实验动物许可证号：SYXK(滇)K2017-0009】。Trizol和Lipofectamine 2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司)；TRAF6和β-actin引物(广州华大基因科技有限公司)；抗TRAF6抗体(美国Abcam公司)；抗IκBα、抗NF-κB p65、抗NF-κB p50、抗p-NF-κB p65和抗p-NF-κB p50抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；检测ALT和AST试剂盒(中生北控生物技术有限公司)；检测IL-1β和IL-6 的ELISA试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)。

1.2 AIH大鼠模型的建立 取大鼠20只，制备肝细胞特异性抗原S-100。随机选择10只大鼠作为正常组，正常饲养，在另30只大鼠，根据参考文献[6]，采用特异性抗原S-100诱导AIH大鼠模型。将造模大鼠随机分为模型组、空载体组和干扰组(TRAF6 shRNA组)，每组10只。在空载体组和TRAF6 shRNA组，采用脂质体法分别转染没有插入外源基因的载体(control-shRNA)和TRAF6 shRNA，而给予模型组生理盐水腹腔注射，1次/d，连续7 d。

1.3 肝组织TRAF6 mRNA水平和蛋白表达检测 采用qRT-PCR检测TRAF6 mRNA水平，用Trizol提取肝组织总RNA，逆转录成cDNA。取cDNA 1 μl，行qRT-PCR。采用2-△△Ct法计算TRAF6基因相对水平。TRAF6正向引物：5′-AAGATTGGCAACTTTGGGATG-3′，反向引物5′-GTGGGATTGTGGGTCGCTG-3′；β-actin正向引物：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，反向引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。取大鼠肝组织，常规切片，4 μm。将切片脱蜡、水化、抗原修复；加兔抗TRAF6单克隆抗体孵育1 h，PBS冲洗，滴加山羊抗兔二抗孵育10 min。滴加DAB显色剂，行苏木素复染。依次经过无水乙醇各5 min，二甲苯20 min，用中性树脂封片。在显微镜下观察。

1.4 肝组织IL-1β和IL-6水平检测 取肝组织制成匀浆，离心取上清，采用ELISA法检测。

1.5 肝组织NF-κB通路相关蛋白表达检测 提取肝组织总蛋白，以BCA法行蛋白定量。采用Western blot法检测，经琼脂糖凝胶电泳、转膜、封闭，加一抗(1:1000)，4℃过夜，加二抗(1:2500)，室温孵育1 h。显影，应用Image J分析软件计算蛋白表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织TRAF6蛋白表达情况 TRAF6阳性表达定位于细胞质，呈棕黄色染色颗粒。与正常组比，模型组大鼠肝组织TRAF6蛋白表达显著增强(P<0.05)；与模型组比，TRAF6 shRNA干预组大鼠肝组织TRAF6蛋白表达显著减弱(P<0.05，图1)。

图1 各组大鼠肝组织TRAF6蛋白表达比较(SP，200×)A:正常组；B：模型组；C：空载体组；D：TRAF6 shRNA干预组

2.2 各组大鼠肝组织TRAF6 mRNA水平比较 与正常组比，模型组大鼠肝组织TRAF6 mRNA水平显著升高(P<0.05)；与模型组比，TRAF6 shRNA干预组大鼠肝组织TRAF6 mRNA水平显著降低(P<0.05，表1)。

表1 各组大鼠肝组织TRAF6 mRNA水平比较

2.3 各组大鼠肝组织IL-1β和IL-6水平比较 与正常组比，模型组大鼠肝组织IL-1β和IL-6水平显著升高(P<0.05)；与模型组比，TRAF6 shRNA干预组大鼠肝组织IL-1β和IL-6水平显著降低(P<0.05，表2)。

表2 各组大鼠肝组织匀浆细胞因子水平比较

2.4 各组大鼠血清ALT和AST水平比较 与正常组比，模型组大鼠血清ALT和AST水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；抑制TRAF6基因表达后，大鼠血清ALT和AST水平显著降低(P<0.05，表3)。

表3 各组大鼠血清ALT和AST水平比较

2.5 各组大鼠肝组织病理学变化情况 在光镜下，正常组大鼠肝组织结构正常，肝细胞结构清晰，未见明显的炎症细胞浸润；模型组和空载体组大鼠肝组织结构排列不规则，肝细胞体积增大，可见少许空泡样变性，部分肝组织可见局灶性坏死，存在明显的炎性细胞浸润；TRAF6 shRNA干预组大鼠肝细胞水肿减轻，炎性细胞浸润明显减少(图2)。

图2 各组大鼠肝组织病理学表现(HE，200×)A:正常组；B：模型组；C：空载体组；D：TRAF6 shRNA干预组

2.6 各组大鼠肝组织NF-κB信号通路相关基因蛋白表达比较 与正常组比，模型组和空载体组大鼠肝组织NF-κB信号通路相关蛋白表达均显著增强(P<0.05)；与模型组比，抑制了TRAF6基因表达后大鼠肝组织NF-κB信号通路相关蛋白表达显著减弱(P<0.05，图3、表4)。

图3 各组大鼠肝组织NF-κB信号通路相关基因蛋白表达比较A:正常组；B：模型组；C：空载体组；D：TRAF6 shRNA干预组

表4 各组大鼠肝组织NF-κB信号通路相关基因蛋白表达水平比较

3 讨论

AIH系较难控制的慢性肝炎[7]。促炎细胞因子IL-1家族成员和IL-6在进一步激活自身免疫反应效应细胞、促进免疫反应和自身免疫性疾病的形成等方面发挥重要作用。AIH是一种主要由T细胞介导的疾病，IL-1和IL-6被认为是肝细胞被破坏的两个主要因素，它们的血清水平与转氨酶水平、细胞死亡标志物和疾病严重程度标志物直接相关[8-10]。另有研究报道，在肝脏受到损伤时，血清ALT和AST水平升高在一定程度上能够反映肝细胞的损伤程度[11]。本研究结果发现，与正常组比，模型组大鼠肝组织匀浆IL-1β和IL-6水平、血清ALT和AST水平均显著升高。模型大鼠肝细胞体积增大，排列不规则，可见少许空泡样变性，部分肝组织可见局灶性坏死，存在明显的炎性细胞浸润，提示大鼠肝组织炎症损伤明显，模型建立成功。

TRAF6介导多种生理和病理学过程，在许多具有免疫调节功能的受体家族中被认为是下游因子，在发育、体内平衡和癌症发生过程中具有重要作用。有研究表明，ConA可诱导AIH并明显促进TRAF6表达[12]。应用左旋四氢巴马汀可通过抑制TRAF6/JNK通路的凋亡和自噬作用，减轻ConA诱导的AIH动物的急性肝损伤[13]。TRAF6处理还可显著提高人肾小球系膜和肾小管上皮细胞IL-1β、IL-6和TNF-α水平[14]。本研究采用脂质体法转染TRAF6 shRNA，以探讨降低TRAF6表达对AIH大鼠的影响，结果表明与模型组比，TRAF6 shRNA处理组大鼠肝组织TRAF6 mRNA水平显著降低，大鼠肝组织匀浆IL-1β和IL-6水平、血清ALT和AST水平均显著降低。抑制TRAF6表达后大鼠肝组织细胞水肿减轻，肝组织炎性细胞浸润明显减少，提示抑制TRAF6表达可降低AIH大鼠肝组织炎症水平，改善肝组织损伤。

NF-κB信号转导缺陷与严重的免疫缺陷有关，而该途径的激活失调是各种自身免疫和炎性性疾病的发病机理[15，16]。炎性细胞因子IL-1与其受体结合后可激活典型的IKK/NF-κB信号传导，而TRAF6是NF-κB信号转导的关键介质。当其激活时，TRAF6启动炎症级联扩增，导致组织损伤和器官功能障碍[17，18]。有研究发现，ConA诱导AIH小鼠可激活肝脏NF-κB信号，促进肝组织炎症反应[19]。另有研究发现，TRAF6可通过激活IκB激酶，促进IκB磷酸化及其降解，从而激活NF-κB信号通路，完成下游炎症信号的传递[20]。本研究结果发现，抑制TRAF6基因表达后大鼠肝组织NF-κB信号通路相关蛋白表达均显著降低，提示抑制TRAF6基因表达可通过抑制p-NF-κB p65和p-NF-κB p50蛋白水平，从而抑制NF-κB信号通路的活化。

综上所述，抑制TRAF6基因表达可通过降低AIH大鼠肝组织炎症水平，改善肝组织损伤，其机制可能是抑制了NF-κB信号通路的活化有关。