非酒精性脂肪性肝炎患者外周血跨膜蛋白6超家族成员2基因表达与心血管疾病的关系*

吴丽蒙，龚 翔，张 燕

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变和肝小叶炎症为特征的临床病理综合征。心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是NASH患者的主要死亡原因。NASH患者发生CVD越严重，死亡的几率越大[1]，表明CVD严重影响NASH病情进展和预后。对NASH患者外周血跨膜蛋白6超家族成员2(transmembrane 6 superfamily member 2，TM6SF2)基因水平研究发现其基因变异可降低血脂水平或对心血管疾病的发生起保护作用，提示TM6SF2基因表达状态或与NASH患者出现CVD有关[2]。TM6SF2为跨膜蛋白，其亚细胞结构主要位于内质网和高尔基体，能够调节胆固醇代谢，与早期动脉粥样硬化的形成有关[3]，但目前尚不知其与NASH患者出现CVD的内在联系。本研究通过分析NASH患者外周血TM6SF2基因rs58542936位点多态性和CVD发生情况，探讨了其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2018年9月～2020年9月我院诊治的NASH患者93例，男51例，女42例；年龄为42～61岁，平均年龄为(55.8±7.6)岁。符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[4]的诊断标准，BMI为(25.1±3.0)kg/m2。排除酒精性肝病、病毒性肝炎、自身免疫性肝病和药物性肝损伤患者。本研究经我院医学伦理委员会审核通过，患者签署知情同意书。

1.2 外周血TM6SF2基因rs58542936位点多态性检测 取血液200 μl，加入缓冲液200 μl和蛋白酶K 20 μl，震荡混匀，放置片刻，加入缓冲液BD 350 μl，充分混匀，离心，将混合液放入含有吸附柱的收集管中回收液体，然后依次加入缓冲液GDB 500 μl、漂洗液PWB 600 μl。每加入一种液体，均在12000 r/m下离心30 s，去除液体，而后于吸附膜中间位置滴加洗脱缓冲液TB 100 μl，室温下放置2 min，在12000 r/m下离心2 min，获得检测样本，使用紫外分光光度仪检测DNA纯度，加入ddH2O将DNA稀释到20 μg/μl。应用TaqMan探针法行TM6SF2基因rs58542936位点分型，引物序列为rs58542936-F：TGTCTCAGAACAAACAAACAAACAGA；rs58542936-R：GTAGGGGG

TGGTGAGGAAGAAC。采用PCR法扩增，反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s、60℃退火/延伸1 min，共40个循环。然后，将得到的样品分装至384孔板中，通过聚类分型和扩增曲线进行基因序列检测，依据终点荧光的读取，自动行等位基因分型。对单独出现一种荧光信号者，判定为纯合性；同时出现两种标记的荧光信号者为杂合型。

1.3 心功能指标检测 使用Philip IE33型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率为2.0～5.0 MHz，测量左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和颈动脉内中膜厚度(intraarterial media thickness，IMT)。根据《实用临床心脑血管病学》诊断CVD。

2 结果

2.1 TM6SF2基因rs58542936位点基因型和等位基因分布 本组经超声检查，诊断合并CVD 35例；经检测，两组TM6SF2基因rs58542936位点等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡法则，基因型分布存在显著性差异(P<0.05)，而等位基因T和C分布差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 两组TM6SF2基因rs58542936位点基因型和等位基因频率分布(%)

2.2 NASH患者发生CVD的单因素分析 CVD组在BMI≥24 kg/m2、TC≥5.2 mmol/L、吸烟、有心血管疾病家族史、合并糖尿病和TM6SF2基因rs58542936位点为杂合型占比显著高于NASH组(P<0.05，表2)。

表2 两组有关指标(%)比较

2.3 影响NASH患者发生CVD的多因素分析 经多元Logistics回归分析，发现BMI≥24 kg/m2、TC≥5.2 mmol/L、有心血管疾病家族史、合并糖尿病和TM6SF2基因rs58542936位点为杂合型是影响CVD发生的危险因素(P<0.05，表3)。

表3 NASH患者发生CVD的多因素分析

2.4 TM6SF2基因rs58542936位点纯合型与杂合型患者血脂和心功能指标比较 杂合型人群血清TC和TG水平显著高于纯合型，LVEF和IMT也显著大于纯合型(P<0.05，表4)。

表4 TM6SF2基因rs58542936位点纯合型与杂合型血脂和心功能指标比较

2.5 TM6SF2基因rs58542936位点多态性对NASH患者发生CVD的预测价值分析 TM6SF2基因rs58542936位点多态性预测NASH患者发生CVD的AUC为0.66395，95%CI为(0.590～0.731，P<0.05)。

3 讨论

相关报道指出，TM6SF2基因参与肝细胞分泌极低密度脂蛋白的途径，并能影响调节脂质合成[6-10]。TM6SF2位于19号染色体上，其表达具有一定的组织特异性，主要分布于肾脏、脑组织、小肠和肝脏中，可通过调节甘油三酯分泌、增加细胞内浓度，影响肝脏脂质代谢[11,12]，而心脑血管疾病的发生与机体血脂代谢异常存在密切联系，提示TM6SF2基因多态性或与心脑血管疾病的发生有关。本研究通过对CVD患者进行分析，结果发现BMI≥28kg/m2、TC≥5.17mmol/L、有心血管疾病家族史及TM6SF2基因rs58542936位点为杂合型是影响CVD发生的危险因素，表明CVD的发生与TM6SF2基因rs58542936位点多态性等有关，这主要与血脂代谢异常可增加亚临床动脉粥样硬化及冠脉疾病的风险有关[13,14]。

NASH的发生与内皮功能障碍、氧化应激和胰岛素抵抗有关，NASH内皮功能异常不仅会导致疾病进展，还会诱发CVD[15,16]。NASH脂质代谢异常可导致血管内皮细胞损伤及功能改变，使内皮细胞脱落坏死，并可增强单核细胞和T细胞的粘附，促进其向内皮下移行，还可诱导细胞表达多种粘附分子，促进动脉粥样硬化的发生，进而可能会诱发CVD。而rs58542936位点多态性与NASH患者机体脂代谢异常有关，提示其可能与CVD的发病过程有关。本研究结果发现，TM6SF2基因rs58542936位点多态性会增加NASH患者CVD的风险，提示或可通过检测该位点基因多态性来预测其是否会出现CVD。本研究中发现，TM6SF2基因rs58542936位点多态性对NASH患者出现CVD具有诊断价值。其原因在于，TM6SF2参与了PPAR的信号通路环节。而PPAR参与了全身和肝脏的脂质代谢过程，可调节肝脏从外周组织摄取脂肪酸的能力及脂蛋白载运能力，其表达异常时会导致脂肪在肝脏堆积，并能影响全身脂质代谢[17,18]，故而会增加心脑血管发生的危险性，故可通过检测TM6SF2基因多态性来预测患者患CVD的概率。

内脏脂肪组织被认为是心血管事件和代谢状况风险增加的重要指标，而心外膜脂肪组织与内脏脂肪组织有相同的胚胎起源，是沉积在心肌和心包之间的内脏脂肪组织，可表达多种细胞因子和蛋白，影响血管内皮功能。本研究发现，TM6SF2基因rs58542936位点杂合型TC、TG水平高于纯合型，LVEF、IMT值大于纯合型，表明TM6SF2基因rs58542936位点杂合型患者的心功能较差，这主要是因为该位点基因多态性可能会抑制内脏脂肪组织代谢，导致大量胆固醇在内脏蓄积，并能诱导血管平滑肌细胞血小板源性生长因子的表达，促进血管平滑肌增生，影响血管舒张、收缩及血液凝固过程，间接促进动脉粥样硬化形成，而影响患者心脏功能。