利用超微量光度计评价脂肪组织总RNA提取方法的改进效果

何 萍 徐春阳 马 鹏 王子婧 侯碧玉 强桂芬 * 杜冠华*

(1.中山大学附属第八医院，深圳 518033； 2.北京协和医学院 中国医学科学院药物研究所药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050；3. 首都医科大学附属北京妇产医院，北京 100026)

RNA的分离和鉴定对于研究组织特异性基因表达以及探究多种细胞调控过程具有重要意义。RNA提取过程中易于受到基因组DNA、蛋白质以及苯酚等的污染，影响RNA质量，从而直接影响实验结果。因此，为了利用RNA进行基因表达和调控等相关研究且得到可靠的研究数据，提取得到高产量、高纯度的RNA至关重要。

脂肪组织是一种重要的能量调控和分泌器官，主要分为白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT)和棕色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT)。脂肪细胞是脂肪组织的主要组成成分，分布于由结缔组织纤维构成的松散的网状结构中。白色脂肪细胞是一种球形的单房细胞，由甘油三酯组成的单个脂滴占细胞体积的90%以上，并含有细长的，数量可变的线粒体，主要负责储存能量。相比之下，棕色脂肪细胞通常是具有可变直径的多边形的多房细胞，含有多个大小不一的脂滴，线粒体丰富，血管化程度高，通过非震颤产热耗散能量[1, 2]。白色脂肪组织又可分为内脏脂肪组织(visceral adipose tissue, VAT)和皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue, SAT)。内脏脂肪组织含有许多致病性的大脂肪细胞，而皮下脂肪组织则含有更多小脂肪细胞，这些小脂肪细胞对胰岛素更敏感，更易于吸收游离脂肪酸和甘油三酯，防止它们在非脂肪组织中沉积。此外，与皮下脂肪组织相比，内脏脂肪组织具有更多的血管、更丰富的血液供应和更强的神经支配[3]。研究显示，内脏脂肪组织的过度堆积与肥胖、糖尿病以及心血管疾病发病率的升高密切相关[4]。然而皮下脂肪组织的增加显示出较小的代谢危险性，甚至可能具有保护作用[5, 6]。由于脂肪组织组成成分的特殊性，单位体积的脂肪组织中RNA含量较少，且小鼠的脂肪组织较少，常规用于致密性组织RNA提取的方法较难获得高质量的脂肪组织RNA，常需通过加大样本量或试剂用量，延长裂解时间才能获得所需RNA[7]，造成了较大的样品及试剂浪费，且RNA质量不好往往影响实验结果。基于此，本研究以小鼠脂肪组织为材料，通过比较不同的组织破碎方法并优化后续提取步骤，对脂肪组织RNA的提取方法进行了改进，采用超微量分光/荧光光度计对RNA质量进行评价，从而获得符合科研要求的高得率、高质量的脂肪组织总RNA。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂

戊巴比妥钠(P3761)、TRIzol(TR201)、无水乙醇(色谱级)；RNA提取试剂盒(R2052)；OMNI Bead Ruptor 24多功能研磨珠均质器；手持式匀浆机 (F6/10)；DS-11FX/FX+超微量分光/荧光光度计。

1.2 实验动物

8周龄C57BL/6N雄性小鼠，体重22～24 g，购于某实验动物技术有限公司(SPF级，许可证编号SCXK(京) 2016-0006)，动物福利和实验过程均遵循中国医学科学院动物伦理委员会的规定。

1.3 脂肪组织取材

小鼠腹腔注射0.45%戊巴比妥钠(45mg·kg-1)麻醉，下腔静脉取血，随后分别于附睾区取出内脏脂肪组织，于腹股沟区取出皮下脂肪组织，于肩胛骨区取出棕色脂肪组织，液氮冻存。

1.4 总RNA提取

1.4.1脂肪组织破碎

1.4.1.1多功能研磨珠均质器脂肪组织破碎

(1)于研磨管中加入5颗研磨珠并加入700 μL TRIzol，置于冰上，加入约50 mg内脏脂肪组织，或30 mg皮下脂肪组织，或20 mg棕色脂肪组织。

(2)于多功能研磨珠均质器中进行脂肪组织研磨，研磨速度6.00 m/s，研磨5次，每次8 s。研磨结束观察匀浆液均匀，无块状组织。

1.4.1.2 手持式匀浆机脂肪组织破碎

(1)于4 mL EP管中加入700 μL TRIzol，置于冰上，加入约50 mg内脏脂肪组织，或30 mg皮下脂肪组织，或20 mg棕色脂肪组织。

(2)应用手持式匀浆机对置于冰上的脂肪组织进行研磨，研磨速度5000转/分，每次30 s，等待10 s，研磨5次，研磨结束观察匀浆液均匀，无可见块状组织。

1.4.2脂肪组织总RNA提取

(1)4℃，12000 r·min-1，离心5 min。

(2)取不含油脂上清液，加入等量无水乙醇，混匀，4℃，12000转/分，离心1 min。

(3)取上清液，加入连有收集管的过滤柱中，12000转/分，常温离心1 min。

(4)换新的收集管，于过滤柱中加入400 μL RNA PreWash缓冲液，12000转/分，常温离心30 s。

(5)弃去收集管中液体，重复步骤(4)。

(6)弃去收集管中液体，于过滤柱中加入700 μL RNA Wash缓冲液，静置2 min，12000转/分，常温离心30 s。

(7)弃去收集管中液体，12000转/分，常温离心2 min。

(8)将过滤柱转移至1.5 mL无菌EP管中，于过滤柱中滴加25 μL无核酸酶水，室温静置5 min。13000转/分，室温离心1 min，将EP管置于冰上待测。

1.5 RNA质量检测和定量

采用超微量分光/荧光光度计进行所提取RNA 的质量检测和定量。该仪器使用分光光度法，参照不同分子的吸收特性进行吸光度的测定，以获得样品中特定分子的存在和含量情况。

(1)开机后，选择RNA模式，使用干燥的实验室擦拭用纸仔细清洁样品放置处，吸取1μL提取时使用的无核酸酶水到样品测量尖端，闭合臂，点击blank进行校准，仪器运行完成后吸去液体。

(2)小心吸移1μL样品到测量尖端，闭合臂后点击sample进行测量，读取RNA浓度值和A260/230、A260/280的比值并记录，立即仔细擦拭后继续进行下一样品的测量。全部测量完成后再次清理仪器，退出程序并关闭电源。

(3)A260/230和A260/280比值一般分别被用来检测核酸样品中的有机物和蛋白质污染，其正常值应分别为：接近2.0，处于1.8～2.1之间。过低的A260/230(低于1.8)表明样品中有较为严重的有机物污染，而A260/280比值较低表明样品中含有蛋白质污染。

2 结果

2.1 内脏脂肪组织总RNA提取方法比较

与皮下脂肪组织和棕色脂肪组织相比，内脏脂肪组织含有更多的大脂肪细胞，脂质含量更为丰富，而RNA含量相对较少，因而增加了内脏脂肪组织总RNA提取的难度[3]。本研究首先利用多功能研磨珠均质器对内脏脂肪组织进行破碎，然后进行后续RNA提取工作。结果如表1所示，该方法提取出的总RNA浓度较低，不利于进行后续的逆转录操作，且A260/230数值较低，表明存在一定程度的有机物污染问题。接下来，我们改用手持式匀浆机对内脏脂肪组织进行破碎，并在后续RNA提取过程中延长RNA Wash缓冲液洗脱时间。由表1列出的实验结果可知，通过方法的改进，提取得到的内脏脂肪组织总RNA的浓度明显升高，得率稳定，并且质量良好，极大地减少了有机物类等的污染。

表1 两种方法提取内脏脂肪组织总RNA的质量比较

2.2 皮下脂肪组织总RNA提取方法比较

脂肪组织是一种特殊的结缔组织，并且在3种脂肪组织中，皮下脂肪组织中结缔组织纤维含量最为丰富。研究显示，腹部和臀部的皮下脂肪组织皆富含纤维结构，且老年个体与年轻个体相比，皮下脂肪中较粗的结缔组织网状结构增加，脂肪细胞周围结缔组织网状结构增厚[8]。由于结缔组织基质的存在，使得皮下脂肪组织在RNA提取过程中较难完全破碎，从而影响总RNA的得率与质量。本研究首先应用多功能研磨珠均质器对皮下脂肪组织进行破碎，再进行RNA提取。实验结果如表2所示，通过该方法得到的总RNA浓度较低，得率差异较大，且RNA质量不佳，难以用于后续科学研究。随后，实验使用手持式匀浆机进行皮下脂肪组织破碎，并进行RNA提取。如表2所示，应用该方法获得的总RNA浓度较高，得率较为稳定，且质量较好，能够满足后续科学研究要求。

表2 两种方法提取皮下脂肪组织总RNA的质量比较

2.3 棕色脂肪组织总RNA提取

与白色脂肪组织相比，棕色脂肪组织含有多腔脂滴结构，富含线粒体，血管密集，结构较为致密[9]，因此相较于白色脂肪组织更易于提取总RNA。我们分别应用多功能研磨珠均质器和手持式匀浆机对棕色脂肪组织的总RNA进行了提取。如表3所示，通过两种提取方法获得的总RNA均浓度较高，质量较好，能够应用于后续研究，因此这两种方法皆可以用于棕色脂肪组织总RNA的提取。

表3 两种方法提取棕色脂肪组织总RNA的质量比较

3 讨论

脂肪组织是机体中一种重要的调节及分泌器官，它对于机体的营养供应及适应环境温度变化具有重要作用。脂肪组织功能紊乱是导致肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病的主要危险因素[10]。因此，对于脂肪组织的深入研究对于治疗代谢性疾病和心血管疾病，维持机体健康具有重要意义。脂肪组织主要由成熟的脂肪细胞组成，并富含结缔组织纤维，因而脂质含量高，组织韧性大，单位体积细胞数量和RNA含量相对较少[7]，因此难于从脂肪组织中提取得到高质量总RNA。

为了获得符合科学研究要求的高得率、高质量脂肪组织总RNA，本研究对组织总RNA的常规提取方法进行了比较与改进，并利用超微量分光/荧光光度计进行RNA质量检测。由于组织细胞破碎是提取组织RNA的关键环节，破碎的完全程度能够直接影响所提取获得的组织总RNA的产量和质量，因此我们分别使用了多功能研磨珠均质器和手持式匀浆机对小鼠脂肪组织进行了破碎处理。实验结果显示，由于手持式匀浆机操作可控性更强，机械性能好，使得破碎更为充分，因而适用于内脏脂肪组织和皮下脂肪组织总RNA的提取。而多功能研磨珠均质器由于操作简便，省时省力，因而更适用于较为致密的棕色脂肪组织总RNA的提取。除此之外，RNA提取过程中容易发生有机物类及蛋白质污染，严重影响RNA质量，因此本研究也对脂肪组织总RNA提取试剂盒的提取步骤进行了优化，延长Wash buffer的保留时间，清除残留的有机物类污染，从而得到高得率、高质量的总RNA。

综上所述，本研究通过比较和改进传统组织总RNA提取方法，优化了适用于小鼠脂肪组织总RNA的提取方法，其优点为节省脂肪组织用量，获得的脂肪组织总RNA产量高，质量好，能够满足脂肪组织基因表达和调控等相关研究的要求，获得满意的实验结果。