慢性乙型肝炎患者血清内质网应激指标变化及其临床意义*

吴 慧，宋 波，吕承秀，田文君，牛家峰

有报道显示，HBV在肝细胞内的持续复制可引起内质网应激反应，并与肝细胞损伤和肝癌的发生等密切相关，但关于HBV诱导肝细胞内质网应激反应的机制尚不明确[1，2]。内质网属哺乳动物细胞内新合成的蛋白质和肽链折叠和修饰及脂类和糖类合成的关键场所。当各种生理病理学因素诱发内质网稳态失衡时，会引起内质网腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的大量聚集，改变钙离子浓度，最终诱发内质网应激[3，4]。外周血内质网应激相关指标，如葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、内质网应激转录因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)和天冬半胱氨酸特异性蛋白酶-12(caspase-12)等，均为反映内质网应激反应较为敏感的指标。以往报道显示，内质网应激参与了肝纤维化的发生、发展或逆转过程，但其在肝纤维化各阶段中的作用机制尚未完全明确[5]。本研究检测了CHB患者外周血内质网应激相关指标的变化，旨在为临床诊治提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2017年5月～2020年5月我院收治的CHB患者109例，男72例，女37例，年龄18～65岁，平均年龄为(38.5±12.4)岁；乙型肝炎肝硬化患者91例，男50例，女41例，年龄22～66岁，平均年龄为(42.9±14.1)岁。符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[6]的诊断标准；原发性肝癌(primary liver cancer, PLC)患者76例，男40例，女36例；年龄32～70岁，平均年龄为(49.7±14.0)岁。符合《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》[7]诊断标准。排除标准：合并其他病毒感染、合并酒精性肝病、自身免疫性肝病、脂肪性肝病、代谢性肝病、药物性肝损伤、上消化道大出血、精神疾病、妊娠或哺乳期妇女。另选择健康志愿者120例，男65例，女55例，年龄23～68岁，平均年龄为(42.8±12.6)岁。所有纳入人群签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会审批。

1.2 检测方法 使用美国贝克曼库尔特公司生产的DXC800型全自动生化分析仪检测血生化指标；采用放射免疫法检测血清透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层黏蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原肽(procollagen-Ⅲ-peptide，PⅢP)和Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)水平(杭州康拓生物科技有限公司；采用ELISA法检测血清GRP78、CHOP和caspase-12水平(美国Proteintech公司试剂，美国Bio-Rad公司生产的I550型酶标仪)。

2 结果

2.1 四组肝功能指标比较 三组肝病患者血清ALT、AST、GGT和ALP水平显著高于健康人(P<0.05，表1)。

表1 四组肝功能指标比较

2.2 四组血清肝纤维化指标比较 三组肝病患者血清HA、LN、Ⅳ-C和PⅢP水平显著高于健康人(P<0.05)，而肝硬化和肝癌患者血清肝纤维化指标显著高于CHB患者(P<0.05，表2)。

表2 四组血清肝纤维化指标比较

2.3 四组血清内质网应激指标比较 三组肝病患者血清GRP78、CHOP和caspase-12水平显著高于健康人，而肝硬化和肝癌组血清上述指标水平显著高于CHB组(P<0.05，表3)。

表3 四组血清内质网应激指标比较

3 讨论

CHB是由HBV感染导致的慢性肝脏炎症性疾病，具有发病率高、病程长、难治愈、易反复等特点，发病机制尚未完全明确，主要涉及HBV感染和人体免疫应答系统。通常认为，HBV并无肝细胞毒性，但感染HBV后可刺激机体形成特异性抗体(体液免疫)和特异性致敏的淋巴细胞(细胞免疫)，诱发机体产生一系列免疫反应[8]。有报道认为，内质网应激可能参与多种肝脏疾病的发生、发展和转归，而HBV等病毒感染可引起肝细胞内质网应激反应，并与病毒复制和肝癌的发生等密切相关[9]。目前，关于内质网应激水平与CHB患者肝纤维化和肝损伤的关系，临床相关报道较少。

HBV复制并不会诱发肝细胞损伤，而HBV抗原会促使人体免疫细胞被激活，攻击表达HBV抗原的肝细胞，从而引起细胞凋亡，同时募集炎症细胞浸润，加重肝组织损伤[11]。另有报道认为，HBV感染后是否引起肝损伤取决于病毒与机体免疫的相互作用，而HBV免疫介导肝损伤机制主要包括固有免疫、T细胞免疫、抗体依赖细胞介导的细胞毒性[12]。HBV引起肝细胞损伤，其可能的机制包括以下方面：(1)HBV蛋白过度表达，引起肝细胞毛玻璃样改变；(2)HBx基因编码HBV x抗原，经与宿主间的相互作用，调节转录、细胞增殖、蛋白降解，引起肝细胞凋亡和坏死；(3)在caspase依赖途径下HBV结合RNA编码的HBV剪切蛋白直接引起肝细胞凋亡，或经免疫反应介导肝损伤。

本研究结果显示，三组肝病患者血清HA、LN、Ⅳ-C和PⅢP水平均显著升高，与既往报道[13]相符，提示CHB和乙型肝炎肝硬化患者均存在肝纤维化。有报道显示， 约28%～37%血清ALT持续正常的CHB患者亦存在显著的肝纤维化[14]。肝纤维化进程的中心环节，即肝星状细胞激活和成纤维细胞活化、细胞外基质产生与降解失衡[15]。在自身免疫反应异常、病毒感染等因素的长期作用下，炎症反复发作，致使肝组织过度修复，引起实质细胞再生和间质组织重建，导致调控细胞外基质产生与降解和细胞外基质降解与清除之间平衡丧失，引起结缔组织过度沉积，血清HA、LN、PⅢP和Ⅳ-C水平显著上升，最终诱发肝纤维化的形成。

本研究结果显示，三组肝病患者血清GRP78、CHOP和caspase-12水平显著升高，提示内质网应激确实参与了CHB和乙型肝炎肝硬化的发病。内质网应激参与CHB的发病过程，HBV感染可引起肝细胞内质网应激反应，并与肝细胞损伤和肝纤维化的出现密切相关[16]。GRP78属细胞内质网应激标志性蛋白，可阻止内质网新生肽聚集，调节内质网钙稳态，抗内质网相关性细胞凋亡；CHOP属促凋亡因子，参与内质网应激诱导的细胞凋亡；caspase-12介导内质网应激诱导的细胞凋亡，属内质网应激特有的凋亡途径[17]。内质网应激能促使细胞内多条信号传导通路被激活，早期经增强蛋白质折叠、诱导受损蛋白质降解、促使蛋白质合成减少等方式减轻内质网应激反应，促使细胞稳态的恢复。一旦肝细胞内质网应激反应持续时间过长，且内质网应激反应程度过强时，肝细胞可经内质网应激反应信号通路促使下游凋亡信号，如CHOP和caspase-12等的激活，诱导细胞凋亡[18，19]。有报道认为，内质网应激可能经调控内质网Ca2+ATP酶和Ca2+平衡，诱导肝损伤，同时伴随着CHOP、GRP78和c-Jun氨基末端激酶水平的上升及细胞凋亡通路的激活，表明肝功能损伤和肝纤维化的发生伴随着内质网应激的发生[20]。本研究发现CHB患者血清内质网应激指标升高，其临床意义还有待探讨。