妥布霉素和亚胺培南联合用药对铜绿假单胞菌有协同抑制效应*

曹 静，向雅婷，孙 玥，王 帆，吴红肖，戴 璐，韩怡婷，褚少朋，俞 娟,***

(1 南通大学附属医院医学检验科，南通 226001；2 南通大学公共卫生学院医学检验系)

铜绿假单胞菌是院内感染极其常见的机会性致病菌之一，有多种毒力因子包括黏附素、侵袭性酶类、多糖荚膜样物质、绿脓菌素以及内、外毒素等，易使铜绿假单胞菌侵入人体并扩散引起感染，导致休克、酸中毒、脓毒血症、白细胞减少等症状[1-2]。铜绿假单胞菌天然耐药且耐药机制复杂，易对临床常用抗生素产生耐药性[3-4]。因此开发新的抗生素种类，使用非抗生素药物或采取新的抗生素组合方案，对临床治疗多药耐药铜绿假单胞菌具有重大意义。

铜绿假单胞菌的耐药机制复杂，一方面由于细菌的外膜屏障、多药外排转运蛋白的存在以及内源性抗微生物灭活作用，铜绿假单胞菌对许多抗生素具有固有耐药[5-6]。另一方面，由于抗生素的广泛使用，多重耐药铜绿假单胞菌分离率居高不下，耐药情况严峻。其耐药机制[7-8]有：(1)细胞膜通透性改变：①细胞膜上外排泵高表达；②膜孔道蛋白丢失或低表达；(2)生物膜形成，细菌能通过生物被膜的形式生存，逃避机体免疫和抗菌药物的杀伤作用；(3)作用靶点改变：①青霉素结合蛋白改变导致青霉素类药物耐药；②DNA 拓扑酶Ⅱ和Ⅳ结构改变导致对氟喹诺酮药物耐药；(4)产生灭活酶或修饰酶：①产生氨基糖苷类钝化酶，这种钝化酶与未钝化的氨基糖苷类竞争细菌细胞内转运系统使其无法与核糖体结合，使得铜绿假单胞菌对氨基糖苷类药物产生耐药性；②产生β-内酰胺酶使铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药[9]。

目前临床上用于铜绿假单胞菌治疗的药物包括青霉素类、碳青霉烯类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类、氨基糖苷类以及喹诺酮类等六大类，但对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、一、二代头孢、头孢替坦、四环素类、甲氨苄啶等药物天然耐药，临床用药时应先排除这些药物的使用。铜绿假单胞菌易对多种抗菌药物产生耐药性的特性常使临床治疗陷入困境[7]。选择合适的联合用药可获得较好的临床疗效，研究联合用药可为临床用药提供合理的指导。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集南通大学附属医院临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌株共103 株。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853、大肠埃希菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923。妥布霉素(Tobramycin,TOB)药敏纸片(Oxoid 公司)、亚胺培南(Imipenem,IPM)药敏纸片(Oxoid 公司)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/Tazobactam,TZP)药敏纸片(Oxoid公司)、头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)药敏纸片(Oxoid公司)、阿奇霉素(Azithromycin,AZM)药敏纸片(Oxoid公司)、TOB 化学试剂(Sigma 公司)、IPM 化学试剂(Sigma 公司)。培养基为M-H 平板(Oxioid 公司)和CAMHB 肉汤(Oxoid 公司)；所用仪器包括96 孔板(Corning 公司)、比浊仪(梅里埃公司)、微量加样枪(Eppendorf 公司)、震荡仪(IKA 公司)、离心机(Hitachi公司)等。

1.2 研究方法 标本的采集、运输、分离培养等过程均严格按照《全国临床检验操作规程》进行。体外抗菌药物敏感试验(antimicrobial susceptibility test,AST)采用WHO 推荐使用的纸片扩散法，为定性药敏试验，折点按照最新公布的美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)文件(M100 版本)标准进行判读，量取抑菌圈并作出敏感、中介和耐药的判断。

1.3 实验方法 使用世界卫生组织细菌耐药性监测中心推荐的WHONET5.5 进行数据分析。首先采取K-B 法药敏试验检测联合用药组合效果，配制0.5 麦氏单位的菌悬液，涂布于琼脂平板上，室温放置，干燥5 min，将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，孵育过夜后观察抑菌圈形状：若两药抑菌圈交界角平直或无抑菌作用的两药之间出现抑菌区，提示两药联合效果为协同作用；若出现两药抑菌圈交界角钝圆，提示两药联合效果为累加作用。筛选出具有协同作用的药物组合。然后采用棋盘稀释法，将筛选出的TOB 和IPM 配制递减浓度的药液：以2 倍最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)作为最高药物浓度，依次倍比稀释得到6～8 个稀释度；挑选孵育了18～24 h 的菌落，使用M-H 肉汤增菌4～6 h，制备0.5 麦氏单位的菌悬液，用生理盐水稀释使菌悬液的最终含菌量为105CFU/mL；在96 孔板中各孔加入递减浓度的抗菌药物和稀释好的菌液，单独用药时每孔加75 μL 抗菌药物和75 μL 菌液，联合用药时每孔加不同稀释浓度的37.5 mL TOB、37.5 μL IPM 和75 μL 菌液，TOB 和IPM 分别在纵列和横列进行，得到不同浓度组合的混合药物，置于37 ℃环境中培养16～20 h 后观察并记录单独使用TOB、IPM 及联合使用时的MIC，并以此为基础计算TOB 和IPM 联合用药的部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)。最后，检测并绘制TOB 和IPM 单独及联合使用时的杀菌曲线。

2 结 果

2.1 不同标本来源的临床铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药性 对来自分泌物、痰液、尿液、血液4 种标本的菌株耐药性进行对比分析，分析的抗菌药物为4 种标本来源菌株常用的抗菌药物中相同的部分。由图1 可见来自痰液标本的铜绿假单胞菌对各种抗菌药物的耐药率均高于来源于其他部位的菌株，其次为尿液中分离出的菌株，血液标本中分离出的铜绿假单胞菌除了替卡西林/克拉维酸、TZP、环丙沙星和左旋氧氟沙星外，对其余常用抗菌药物的耐药性均高于分泌物中分离出来的菌株。

图1 不同标本来源的临床铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药性

2.2 多种药物组合对临床多药耐药铜绿假单胞菌有协同作用 TOB 与IPM、TZP 与AZM、CAZ 与IPM联合用药对铜绿假单胞菌具有协同作用；TZP 与IPM、TZP 与CAZ、CAZ 与AZM、IPM 与AZM 联合用药组合对铜绿假单胞菌具有累加作用。

图2 K-B 法初筛药敏结果

2.3 TOB 和IPM 可协同抑制铜绿假单胞菌活性对TOB 与IPM 进行联合药敏试验。观察并记录TOB和IPM 两种药物单独使用时和联合使用时的MIC，并以此为基础计算FICI，在103 株铜绿假单胞菌中，TOB 和IPM 联合使用时FICI≤0.5(协同作用)的有17 株(16.5%)；FICI 为0.5～1(累加作用)的有37 株(35.9%)；FICI 为1～2(无关作用)的有49 株(47.6%)[10]。未检测到该两药有拮抗作用的试验菌株。由图3 可见TOB 和IPM 联合用药时可显示协同作用。

图3 TOB 与IPM 48 h 杀菌曲线

3 讨 论

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，易引起各种急慢性感染，在感染过程中极易生成生物膜，为菌体带来一定的保护并抵御抗生素的作用[11]。且由于铜绿假单胞菌含有多种毒力因子，多继发于大面积烧伤、白血病、淋巴瘤、恶性肿瘤、静脉导管、心瓣膜置换术及各种严重慢性疾病等，感染难以根除。其引起的败血症占革兰阴性杆菌败血症7%～18%，居第3或第4 位，其死亡率则居革兰阴性杆菌败血症的首位[12]。患者感染铜绿假单胞菌后常使用抗生素，除需避免使用某些对该菌天然耐药的抗生素外，由于铜绿假单胞菌极易对一些原先敏感的抗菌药物在治疗过程中产生耐药性，所以在治疗过程中需对临床分离的铜绿假单胞菌株进行多次体外药物敏感试验，及时换用敏感性高的药物，以免延误治疗。

铜绿假单胞菌对几种临床治疗时常用的抗菌药物的耐药性与其临床分离部位有一定的关系，来自痰液标本的铜绿假单胞菌对所选取各种抗菌药物的耐药率均高于来源于其他部位的菌株，尿液中分离出的菌株耐药率仅次于痰液中分离出的菌株，而血液标本中分离出的铜绿假单胞菌除了对替卡西林/克拉维酸、TZP、环丙沙星和左旋氧氟沙星外，对其余常用抗菌药物的耐药率也均高于分泌物中分离出来的菌株。痰液中分离出的铜绿假单胞菌耐药率高于其他类型标本的原因可能是因为呼吸道感染是铜绿假单胞菌常见的感染方式，但也不排除有定植的可能。因为铜绿假单胞菌是慢性囊性纤维化患者肺部感染常见的病原菌，所以痰液可能是一种十分适合铜绿假单胞菌生长的营养来源。痰液的成分复杂，有炎性物质(白细胞、由于血管渗漏和肺出血进入气道的各种蛋白)、细菌和细菌产物，且痰液的成分在感染期间多变[13]。囊性纤维化患者痰液中有高浓度的蛋白质和氨基酸，可能成为铜绿假单胞菌的碳源和氮源[14]。铜绿假单胞菌的群体感应系统复杂，涉及各种信号分子，喹诺酮信号分子(Pseudomonas quinolone signal,PQS)是其中之一。研究[15]表明囊性纤维化患者痰液中有成分可诱导PQS 的相关基因，使痰液中PQS 水平提高了5 倍。

随着铜绿假单胞菌对多种抗菌药物耐药率的升高，必要时选择合适的联合用药可取得较好的治疗效果，为临床提供更合理的用药指导。其中氨基糖苷类和碳青霉烯类抗生素是目前临床上治疗铜绿假单胞菌的常用药物[16]。

本实验采用K-B 法进行联合药敏试验结果显示TOB 与IPM、TZP 与AZM、CAZ 与IPM、TZP 与IPM、TZP 与CAZ、CAZ 与AZM、IPM 与AZM 联合用药具有协同或累加作用，选取其中TOB 与IPM 进行进一步的棋盘稀释法联合药敏试验。

TOB 是氨基糖苷类药物的一种，常用于革兰阴性杆菌引起感染的治疗，该药物能联结在细菌的30S 和50S 的联结位置，阻止形成70S 复合物，导致mRNA 翻译成蛋白质的过程受到阻碍，从而导致细菌死亡。铜绿假单胞菌耐药的主要原因包括细胞膜通透性低、主动外排泵的过度表达，将异二聚体的利福平与TOB 联合治疗铜绿假单胞菌，可以打破因为以上两种原因引起的固有耐药，并增强了临床多药耐药铜绿假单胞菌对多西环素和氯霉素的敏感性[17]。此外将TOB 与克拉霉素联合，可协同治疗囊性纤维化患者由于铜绿假单胞菌而引起的感染[18]。将TOB 制成纳米颗粒的药物复合物，对黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌分离株抗菌活性都比单独使用TOB 治疗高[19]。所以TOB 单独用药可能易使铜绿假单胞菌产生耐药而使治疗效果不明显，需与临床其他抗菌药物联合使用降低耐药风险提高治疗效果。

IPM 是碳青霉烯类抗生素的一种，与TOB 相似的是，该药物在临床治疗中也可用于革兰阴性杆菌引起感染的治疗。IPM 具有碳青霉烯环，抗菌谱广且抗菌作用强，对各种细菌的青霉素结合蛋白都表现出较好的亲和力。多黏菌素B 通常是治疗多药耐药铜绿假单胞菌的最后的方案，但是带来急性肾损伤的风险很高。有研究[20]指出，IPM 与利福平联合使用可以替代多黏菌素B 成为肾功能不全患者安全的治疗方案。使用阿米卡星治疗多药耐药铜绿假单胞菌时加入IPM 能增加阿米卡星的治疗效果[21]。但IPM在单独使用时在体内的稳定性比较差，大部分都有被肾细胞膜所产生的肾脱氢肽酶分解破坏的可能性。将IPM 与其他药物联合使用可能可以减少被分解的程度，提高治疗效果。

鉴于多药耐药铜绿假单胞菌感染所带来的严重性、单一抗生素疗法带来的耐药风险的增加和新抗生素开发所需时间长等，使联合用药治疗多药耐药铜绿假单胞菌成为目前的研究热点[22]。本研究结果显示，TOB 和IPM 联合使用出现了16.5%的协同作用、35.9%的累加作用，47.6%的无关作用，但未出现拮抗作用。有研究[23]也选用TOB 和IPM 这一组合，对3 株耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌临床分离菌株进行单一治疗和联合应用，发现联合用药效果明显优于两者单独用药。随后通过一种基于药代动力学和药效动力学的数学模型对此药物组合的治疗方案进行优化，在小鼠大腿感染耐IPM 和TOB 铜绿假单胞菌的动物模型中，也得到了相似的结论，且该模型显示TOB 可将IPM 作用靶点的浓度最高提高至原来的2.6 倍[24-25]。证明了TOB 和IPM 这组抗生素组合在临床上有广阔的应用前景。对于部分没有明显协同作用的菌，可能耐药机制存在差异。

综上，TOB 和IPM 联合用药对铜绿假单胞菌具有协同作用，未发现拮抗作用，从TOB 和IPM 单独及联合使用时的杀菌曲线可见这两种药物联合作用时协同作用明显，后续将扩大样本量进行检测，并进一步探讨其具体作用机制，以期为临床抗铜绿假单胞菌感染提供新的用药信息。