肿瘤坏死因子α刺激下人牙髓干细胞与CD3+ T细胞共培养后生物学功能的变化

朱子鹏，刘 娜，李 影，王 辰,2，张 璇,2，顾 斌

1 解放军总医院第一医学中心 口腔科，北京 100853；2 解放军总医院研究生院，北京 100853；3 解放军总医院第一医学中心 骨科研究所，北京 100853

牙 髓干细 胞(dental pulp stem cells，DPSCs)于2000年由Gronthos等[1]在人恒牙牙髓组织中分离培养出，其可多向分化、高度增殖，并且能形成牙髓-牙本质复合体。还能够分化为脂肪、肌肉、软骨、神经等细胞类型。由于其获取方便、易于保存，逐渐成为组织细胞工程中的研究热点。牙髓干细胞可以通过诱导活化T细胞参与机体的免疫调节，是一种理想的干细胞来源，为神经损伤和神经退行性疾病的治疗提供了一种新思路[2]。目前认为牙髓干细胞作为种子细胞参与组织工程有一定优势，但其免疫学特性及作用机制尚不明确。研究发现研究肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)可以通 过 核 转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路促进DPSCs向成骨细胞分化[3]。另有研究发现DPSCs可使调节性T细胞显著增加，辅助性T17细胞减少[4]。CD3+T细胞是主要的免疫效应细胞。所以在本实验中，我们用TNF-α刺激细胞模拟炎症微环境，初步探索在炎症微环境中DPSCs与CD3+T细胞共培养后成骨细胞相关因子、炎性因子和Wnt经典通路因子的mRNA表达情况。

材料和方法

1 材料 α-MEM培养基，胎牛血清(Gibco美国)；PBS缓冲液(HyClone美国)、Ⅰ型胶原酶(Sigma美国)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco美国)、青链霉素(Gibco美国)。人牙髓干细胞成骨诱导分化完全培养基、人牙髓干细胞成脂诱导分化完全培养基(Cyagen美国)、外周淋巴细胞分离液(天津灏洋)、RPMI 1640培养液(Gibco美国)。CCK8试剂盒(日本同仁)；实时定量PCR仪(Applied Biosystems 7500，美国)；RNA提取和逆转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；引物(华大基因)，超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)。CO2恒温孵箱(Thermo，美国)。

2 样本收集 2020年8月于解放军总医院第一医学中心口腔颌面外科门诊获得离体阻生齿8颗，来源于18～35岁成年男性。所有阻生齿要求无龋坏、牙周组织健康、无牙髓炎及根尖周炎；所有患者无系统性疾病，血常规指标正常，无吸烟史，半年内无用药史。另从解放军总医院第一医学中心输血科获取人外周血白膜层细胞浓缩样本4份，来源于20～40岁成年男性，捐献者身体健康，近半年无服药史。以上样本获取均经解放军总医院伦理委员会批准并征得捐献者的知情同意。

3 牙髓干细胞的分离培养 拔牙前充分消毒，将脱落下来的牙放入含1%青链霉素的α-MEM培养基中，在无菌操作台中使用大量PBS溶液对离体磨牙进行表面冲洗，劈冠法取出牙髓并剪碎，装入含有Ⅰ型胶原酶的EP管中，放入37℃恒温箱1 h，期间每隔20 min震荡一下。2 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬混匀后加入培养瓶中，放置于37℃、5% CO2的恒温箱中培养7～10 d。当细胞生长融合至90%时使用胰蛋白酶-EDTA进行消化，标记为第1代。使用有限稀释法克隆化培养人牙髓干细胞，并使用第3～5代进行实验。

4 CD3+T细胞的分离培养 将取得的外周血放入抗凝管中。取10 mL全血加入等体积的PBS溶液混合均匀，向其中先加入20 mL人淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心30 min。取出离心后的液体分为三层，用吸管缓慢吸取中间的白膜层，主要包括淋巴细胞和单核细胞，即外周血单个核细胞。将细胞吸入到15 mL离心管中，加入少量Buffer缓冲液，然后在溶液中加入5 µL CD3+免疫磁珠并混匀，避光孵育20 min，300 g离心10 min，在磁力分选架上分选获得CD3+T细胞。将CD3/CD28免疫磁珠预先洗涤后与CD3+T细胞1∶1混合培养用来细胞激活，3 d后将细胞和磁珠分离，获得的细胞加入含有白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的RPMI 1640培养液中刺激生长，于37℃、5% CO2的恒温箱中培养2～3 d换液，当细胞密度达到2 × 106/mL传代培养。

5 TNF-α刺激DPSC后CCK8检测细胞增殖能力 选择P3代的DPSCs以1 × 105/mL的密度接种于4个96孔板中，每板共接种4组，其中3组为实验组，实验组中的细胞分别用TNF-α浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL的细胞培养液预刺激24 h；1组为对照组，对照组中加入不含有TNF-α的细胞培养液进行细胞培养。待细胞生长融合至80%时开始计时实验。培养细胞1 d、3 d、5 d、7 d后每孔分别加入10 µL CCK8溶液，并在培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。

6 DPSCs向成骨细胞诱导分化实验 将P3代细胞接种到两个6孔板中，两个板分别标记为正常组和刺激组，以2 × 105/mL的细胞密度接种，其中刺激组的细胞用10 ng/mL TNF-α提前刺激24 h。每孔加入含有1%青链霉素、10% FBS的α-MEM培养液，放入37℃恒温箱中培养。当细胞密度汇合至60%时去掉细胞培养液，并用PBS冲洗，换成2 mL成骨培养液进行培养，每隔3 d换液1次，21 d时用PBS溶液冲洗细胞板，用多聚甲醛固定细胞30 min，加入茜素红染色液染10 min，然后洗去染色液，并在显微镜下观察后拍照。

7 DPSCs向成脂细胞诱导分化实验 将P3代细胞以2 × 105/mL的细胞密度接种，每孔加入含有1%青链霉素、10% FBS的α-MEM培养液，放入37℃恒温箱中培养，当细胞密度汇合至60%时去掉细胞培养液，PBS冲洗，改为2 mL成脂培养液培养，每隔2 d换液1次，直到24 d后弃液，PBS溶液冲洗细胞板，用多聚甲醛固定细胞30 min，加入油红O染色液染10 min，洗去染色液，显微镜下观察后拍照。

8 DPSCs与CD3+T细胞直接共培养 将DPSCs消化接种到48孔板中，接种密度为1 × 104/mL，每孔补液至500 µL，待24 h后细胞贴壁，计数CD3+T细胞混悬液密度为2 × 106/mL。按照上述计 数 将DPSCs：CD3+T细 胞 按1∶0、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100比例混合共培养。加入前每组先吸出细胞液0 µL、25 µL、50 µL、125 µL、250 µL，再向每组分别加入0 µL、25 µL、50 µL、125 µL、250 µL CD3+T细胞混悬液，每个浓度设4个副孔，培养48 h，正常组细胞接种后用常规培养液培养，TNF-α刺激组需要将接种后的DPSCs用10 ng/mL TNF-α的培养液刺激培养24 h。

9 qPCR检测DPSCs的炎性因子、Wnt通路相关因子的mRNA表达 48 h后吸出CD3+T细胞悬液，向孔板内用PBS缓冲液冲洗两次，留下贴壁生长的DPSCs。每孔加入Trizol裂解细胞，提取RNA，测浓度后反转录为cDNA，采用Sybr Green试剂盒进行定量PCR检测，反应体系为20 µL。引物序列如表1。反应条件：95℃变性20 min，95℃退火30 s，60℃延伸1 min，40个循环。本实验重复3次，得到的结果取均值。

表1 qPCR引物Tab. 1 Primers of qPCR

10 统计学分析 采用SPSS22.0软件对数据进行分析。组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnett检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞形态观察 分离原代DPSCs，体外培养24 h后可见到少量组织块贴壁于培养皿上(图1A)，3 d后明显可见有贴壁细胞长出，呈集落样的不规则形态(图1B)。10 d后细胞数量明显增多，细胞密度生长汇合至80%开始传代，且生长速度明显加快，传代后第1代细胞呈纺锤状和长条状，并呈漩涡状生长(图1C)。

图1 DPSCs体外分离培养光镜下观察(100×) A：原代细胞培养24 h；B：原代细胞培养3 d；C：P1代细胞Fig.1 Observation of DPSCs isolated and cultured in vitro under light microscope (100×) A: Primary cells were cultured for 24 h; B:Primary cells were cultured for 3 d; C: Passage one cells

2 CCK8法测细胞生长曲线 0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL浓度TNF-α刺激下的DPSCs培养7 d，用分光光度计检测细胞生长曲线，在1 d、3 d、5 d时生长曲线基本重合，7 d时可见10 ng/mL TNF-α刺激下的细胞增殖效果明显，而对照组的细胞增殖相对变慢(图2)。

图2 CCK8法检测不同处理组DPSCs细胞增殖Fig.2 CCK8 assay showing the growth of DPSCs in different groups

3 DPSCs的多向分化能力观察 经过21 d的成骨诱导分化后，镜下可以见到钙结节，并且在10 ng/mL TNF-α的刺激下有更为明显的钙沉积，同时染色更深(图3A ～ 图3D)；经过24 d的成脂诱导，镜下可以见到脂滴的形成(图3E)。说明DPSCs具有间充质干细胞的多项分化诱导能力，且TNF-α刺激下其成骨能力也明显增强。

图3 正常组DPSCs成骨分化诱导21 d，茜素红染色(A、C，200×)；TNF-α刺激组DPSCs成骨分化诱导21 d，茜素红染色(B、D，200×)；正常组DPSCs成脂分化诱导24 d，油红O染色(E，200×)Fig.3 Osteogenic differentiation of DPSCs at 21 days after induction in the normal group by alizarin red staining (A, C, 200×).Osteogenic differentiation of DPSCs in TNF-α stimulation group at 21 days after induction by alizarin red staining (B, D,200×). Adipogenic differentiation of DPSCs in the normal group at 24 days after induction by oil red O staining (E,200×)

4 正常组及TNF-α刺激组DPSCs成骨因子和炎性因子表达水平 成骨诱导液培养7 d，qPCR结果显示，10 ng/mL TNF-α刺激组的Runx2表达是正常成骨诱导培养条件的1.674倍(P＜0.05)，10 ng/mL TNF-α刺激组的ALP表达是正常成骨诱导培养条件的1.515倍(P＜0.05)(图4)。说明在10 ng/mL TNF-α刺激作用下，DPSCs向成骨细胞分化能力明显增强。正常及TNF-α刺激组DPSCs接种于6孔板，常规培养7 d，qPCR结果显示，10 ng/mL TNF-α刺激组的IL-1β表达是正常组的2.314倍(P＜0.05)，10 ng/mL TNF-α刺 激 组 的TNF-α表达是正常组的1.947倍(P＜0.05)(图5)。说明在10 ng/mL TNF-α刺激作用下，DPSCs炎症相关因子的表达水平明显增加。

图4 qPCR检测经过常规培养(Undiff)和成骨细胞诱导培养(Diff) 7 d后正常组DPSCs和TNF-α刺激组DPSCs的Runx2和ALP的mRNA表达水平Fig.4 mRNA expression levels of Runx2 and ALP detected by qPCR after 7 days of routine culture (Undiff) and osteoblast induction culture (Diff) in the normal group and the TNF-α stimulation group

图5 正常组DPSCs和TNF-α刺激组DPSCs常规培养后IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平Fig.5 mRNA expression levels of IL-1 β and TNF- α in the normal group and the TNF-α stimulation group after routine culture

5 CD3+T细胞分离共培养观察 人外周血加入等量淋巴分离液，离心后取中间白膜层，利用磁珠分选得到CD3+T细胞，刺激活化后得到生长良好、活性正常的悬浮状球形细胞。然后选择直接共培养的方法将DPSCs和CD3+T细胞直接混合，共同生长(图6)。

图6 CD3+ T细胞(A)光镜下观察(200×)及与DPSCs直接共培养后(B)光镜下观察(200×)Fig.6 Morphological images of CD3+ T cells (A, 200×) and CD3+ T cells co-cultured with DPSCs directly (B, 200×) under light microscope

6 正常组HDPSCs和TNF-α刺激组IDPSCs分别与CD3+T细胞共培养后炎症和Wnt通路相关因子的表达 将DPSCs与CD3+T细胞按照1∶10～1∶100的比例共培养，发现正常组在1∶20时IL-1β、TNF-α和LEF-1表达分别是DPSCs单独培养的0.314倍(P＜0.05)、0.247倍(P＜0.05)和0.680倍(P＜0.05)。而TNF-α刺激组在1∶20时IL-1β、TNF-α、β-catenin和 淋 巴 样 增 强 因 子1(lymphoid enhancer factor 1，LEF-1)表 达 分 别 是DPSCs单独培养的0.174倍(P＜0.05)、0.321倍(P＜0.05)、1.416倍(P＜0.05)和1.33倍(P＜0.05)。正常组在1∶50时IL-1β、TNF-α和LEF-1表达分别是DPSCs单独培养的0.213倍(P＜0.05)、0.383倍(P＜0.05)和0.490倍(P＜0.05，TNF-α刺激组在1∶50时IL-1β、TNF-α表达分别是对照组的0.255倍(P＜0.05)、0.446倍(P＜0.05)。说明在10 ng/mL TNF-α的刺激下，共培养比例为1∶20时CD3+T细胞能够比较有效地抑制炎症反应，且激活了Wnt/β-catenin经典通路，使β-catenin和LEF-1表达增加。见图7。

图7 正常组(aP＜0.05, vs HDPSCs)及TNF-α刺激组(aP＜0.05, vs IDPSCs)与CD3+ T细胞共培养后炎症和Wnt通路因子的mRNA表达Fig.7 mRNA expression of inflammation and Wnt pathway factors in the normal group (aP＜0.05, vs HDPSCs) and the TNF-α stimulation group (aP＜0.05, vs IDPSCs) after co-culture with CD3+ T cells

讨 论

DPSCs因其具有易获取、成本低、多向分化能力等特点，成为当下组织工程种子细胞的研究热点，在组织损伤、炎症修复等方面具有越来越广泛的应用前景。

在细胞水平上，DPSCs表达间充质干细胞标志物，其表现出较高的碱性磷酸酶活性水平。此外，DPSCs显示出较高水平的成骨和成牙分化标志物，说明DPSCs接近成牙本质细胞的表型，为人牙组织源性间充质干细胞治疗提供一种新思路[5]。Gong等[6]研究发现EPhinB2/EphB4信号在调节DPSCs诱导新生血管生成能力中有重要作用。Wang等[7]研究发现TNF-α参与炎症发生和发展的全过程，是炎症反应中最为关键的核心因子。TNF-α是一系列抗炎过程中的上游因子，有效减少Runx2的表达。已有文献证明高浓度的TNFα通过Wnt/β-catenin信号转导抑制了DPSCs中矿化及矿化相关基因的表达[8]。也有实验结果显示TNF-α可以抑制DPSCs的成骨和成牙本质的分化能力[9-10]。本实验发现TNF-α浓度为10 ng/mL时对DPSCs的促进增殖效果最明显，此时细胞活性较好。也有文献证实该浓度条件下炎性因子的表达最为显著[11]。因此本实验选择10 ng/mL TNFα作为刺激物模拟炎症微环境。

在牙髓组织修复或再生的过程中，DPSCs与局部炎症微环境相互作用，影响牙本质修复再生[12]。炎症反应的过程中常有免疫细胞的参与。牙髓干细胞较骨髓干细胞具有更强的免疫调节活性，可以更好地用来治疗免疫性疾病[13]。慢性牙周炎的早期病变期有大量的淋巴浸润，主要为T淋巴细胞。在成熟的T细胞表面均会表达CD3分子[14]，CD3+T细胞是适应性免疫系统的主要效应细胞，其具有抗原特异性，同时也是同源免疫记忆的关键核心，因此更好地了解调节性免疫细胞，将有利于改进DPSCs的免疫调节治疗策略[15]。这几年最新的研究开发出一种无血清的人工胸腺器官系统，这为研究人类T细胞分化和未来以干细胞为基础的工程T细胞疗法的发展提供了强有力的工具[16]。本实验中实时定量PCR结果显示在DPSCs和CD3+T细胞共培养比例为1∶20时抑炎效果最好，同时也能够激活Wnt经典通路，所以我们选择此比例作为本实验后续的实验设计依据。

Wnt通路是由经典Wnt/β-catenin通路和非经典Wnt/Ca2+和Wnt/PCP信号通路组成。Wnt/βcatenin信号通路是机体各种信号中较为保守的一种，其可以调节多种生物生理过程，尤其是在骨细胞生物学中应用极广，促进DPSCs的成骨向分化，而β-catenin的过度表达也足以抑制DPSCs的分化和矿化[17]。有研究表明炎症微环境下间充质牙源性干细胞的生长以及分化过程中经典以及非经典通路之间存在着拮抗作用[18]。同时Wnt通路的主要作用靶点在转录因子LEF-1和TCF上，它们是Wnt信号通路的主要下游效应因子[19]。当前很多研究均表明Wnt通路与干细胞的干性相关。其中抑制Wnt信号的可以达到抑制DPSCs的迁移、碱性磷酸酶表达和矿化的目的[20]。Lu等[21]通过Wnt1/β-catenin信号转导调控DPSCs的成牙本质细胞分化。因此可以推测在牙髓损伤的早期，可以通过改变Wnt信号通路恢复DPSCs的增殖能力，加快损伤修复的过程。Wu等[22]研究发现通过激活Wnt/β-catenin途径可以使DPSCs促进成牙本质细胞分化，提示其未来可能有助于指导龋病的治疗。Uribe-Etxebarria等[23]发现小分子和(或)重组蛋白对Wnt信号的短暂预处理激活了培养中DPSCs的干性，这为优化其他组织特异性干细胞的治疗用途提供了一种新的思路。另有研究发现，10 ng/mL TNF-α的刺激可增强Wnt信号通路激动剂SIRT1的表达，进而可以增强Wnt信号通路的表达，促进细胞成骨向分化[24]。

Wnt信号通路调节DPSCs的干性和多能性核心因子的表达[25]。本研究结果显示，正常组 -1∶100共培养比例组β-catenin表达水平是正常组 -未共培养组的1.537倍(P＜0.05)，在10 ng/mL的TNF-α的刺激后1∶20的共培养比例组β-catenin表达水平是未共培养组的1.416倍(P＜0.05)，这是否可以说明在CD3+T细胞这类免疫细胞的参与下激活了Wnt/β-catenin经典通路，进一步调控着细胞的成骨、炎症反应和组织的损伤修复？目前对于DPSCs的研究我们只是管中窥豹，许多未知的问题亟待了解和解决，尽管其中许多免疫机制我们还不尽了解，但许多研究已经让我们能够初步梳理出DPSCs在各种微环境中的生物学过程，感受到了其未来广阔的应用前景。其在不同微环境下的免疫反应和状态还有待我们进一步研究。