小分子化合物诱导人胚胎干细胞分化为角膜上皮样细胞

肖文田，秦丽敏，刁玉梅，刘晶劼，王丽强

解放军总医院第一医学中心 眼科，北京 100853

角膜是眼球最前端的无血管高度透明结构，分为5层，最外层为角膜上皮，由于直接暴露于外界环境，容易受到各种理化因素刺激而损伤，其再生主要依赖于角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)[1]。角膜盲是我国第二大致盲原因，约70%角膜盲由角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)导致，主要表现为持续上皮缺损、新生血管入侵和角膜结膜化等[2]。近年来，随着角膜缘上皮干细胞标志物的出现及培养技术和培养载体的不断更新提高，利用细胞移植治疗此类疾病成为研究热点。目前，有多种不同方法用于诱导多能干细胞分化为角膜上皮细胞(corneal epithelial cells，CECs)。拟胚体是诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)或胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外一定培养条件下形成的球状结构，其形态与哺乳动物早期胚胎发育阶段高度相似，具有向内、中、外3个胚层分化的潜能。本研究选用TGF-β通路抑制剂SB505124及经典Wnt信号通路抑制剂IWP-2两种小分子化合物作用于拟胚体，阻断TGF-β和Wnt通路，同时联合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)激活FGF通路，模拟了早期胚胎发育，使人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)向 外 胚层、体表外胚层方向分化，最终分化为角膜上皮细胞，为治疗角膜盲提供了基础实验准备。

材料和方法

1 细胞、试剂及仪器 人胚胎干细胞H9细胞系(hESCs H9)购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司；基质胶(Matrigel)、超低黏附6孔板(Corning公司)；mTeSR1培养基、AggreWellTMEB Formation培养基、Y27632、AggreWellTM800 6孔板(Stemcell Technologies公司)；DMEM/F12、非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)溶液、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)溶液(Gibco公司)；β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、Accutase溶液(Sigma公司)；血清替代物(KnockOutTMSerum Replacement，KSR)、SYBRTMSelect Master Mix(Invitrogen公司)；小分子化合物SB505124、IWP-2(MCE公司)；重组人成纤维细胞生长因子(recombinant human FGFbasic)(PeproTech公司)；EDTA溶液(Ambion公司)；二甲基亚砜(DMSO)(Amresco公司)；不含钙、镁的磷酸盐缓冲液(D-PBS)(索莱宝公司)；ProtoScript®ⅡFirst Strand cDNA Synthesis Kit(NEB公司)；兔抗人Oct4一抗(ab181557)、兔抗人p-63一抗(ab124762)、鼠抗人CK-3一抗(ab68260)(Abcam公司)；FITC山羊抗小鼠二抗(A0568)、FITC山羊抗兔二抗(A0562)(上海碧云天生物技术有限公司)。超净工作台、二氧化碳恒温细胞培养箱(SANYO公司)；倒置相差显微镜(Nikon公司)；倒置荧光共聚焦显微镜及图像分析系统(Leica公司)；qRT-PCR仪(Bio-Rad公司)。

2 细胞培养 将冻存的hESCs H9复苏，重悬于胚胎干细胞专用mTeSR1培养基，加入由Matrigel包被的孔板中，置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养，每天固定时间更换培养基，待细胞融合至85%左右时用0.5 mmol/L的EDTA消化重悬，按1∶3比例进行传代培养。

3 细胞诱导 待hESCs融合至80%左右，生长状态良好，用Accutase将其消化重悬于配制好的完全培养基(EB Formation 培养基加10 µmol/L Y27632)，调整细胞密度为1.2×106/mL，转移至AggreWell孔板，置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养，24 h后可见hESCs全部形成大小均一的拟胚体。将拟胚体转移至超低黏附6孔板，加入EB培养基悬浮培养6 d，悬浮培养第3天时在培养基中加入SB505124(10 µmol/L)、IWP-2(10 µmol/L)和bFGF(50 ng/mL)，对拟胚体进行诱导培养，每日半量更换培养基。诱导4 d后将拟胚体转移至普通6孔板，加入添加激素的上皮培养基(SHEM)继续进行贴壁诱导培养，隔日更换培养基，观察细胞形态。诱导过程见图1。

图1 诱导人胚胎干细胞分化为角膜上皮样细胞方法示意图Fig.1 Schematic diagram of method used to induce human embryonic stem cells to differentiate into corneal epithelial cell

4 RT-qPCR法检测hESCs和诱导后细胞特征性标志物mRNA表达 收集hESCs和诱导10 d、15 d和20 d的细胞，加入相应体积的Trizol裂解液提取总RNA。将RNA按照试剂盒说明书逆转录合成cDNA。8联管中加入10 µmol/L PCR上、下游引物各0.5 µL、cDNA模板1.0 µL、Master Mix 10.0 µL和ddH2O 8.0 µL，配制成20 µL的PCR反应体系。PCR反应条件：95℃预变性2 min，后接40个循环扩增：95℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min。以GAPDH作为内参，采用2−ΔΔCt法计算mRNA表达水平，其中ΔCt(待测基因mRNA)=Ct(待测基因mRNA)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(诱导后细胞待测基因mRNA)-ΔCt(ESCs待测基因mRNA)，诱导后细胞与ESCs的比值表示mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。引物由华大基因科技有限公司合成，各基因引物序列见表1。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

5 免疫荧光法检测细胞OCT4、ΔNp63及CK3蛋白表达 48孔板底部放置专用无菌细胞爬片，hESCs培养需用Matrigel包被板底。hESCs按照“2 细胞培养”中的方法培养；按照“3 细胞诱导”中的方法诱导培养；分别将ESCs和诱导第20天的细胞进行固定。用PBS冲洗3次，于4%多聚甲醛固定液中固定30 min。PBS冲洗，加入0.2%Triton X-100，室温下透化15 min。PBS冲洗，山羊血清室温封闭30 min。封闭液吸出，滴加待测目 标 一 抗(OCT4 1∶250、ΔNp63 1∶300、CK3 1∶50)，4℃孵育过夜。PBS冲洗，滴加相应二抗(1∶500)，避光室温下孵育90 min，PBS冲洗。载玻片中央滴加适量封片剂(含DAPI)，将细胞爬片倒扣于载玻片封片剂上封片，倒置荧光共聚焦显微镜下观察并拍照。

6 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.3.0软件对资料进行统计学分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett's检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 诱导后细胞形态与CECs相似 ESCs呈集落生长，细胞核大，常有2个或多个核仁，胞质少(图2A)。将ESCs消化转移至Aggrewell孔板中培养24 h，可见ESCs全部形成拟胚体，呈表面光滑的球形，密度均匀，大小均一(图2B)。诱导第7天(即贴壁培养第3天)可见有细胞从拟胚体中爬出，排列较为有序，细胞扁平，呈三角形或短梭形，细胞核圆、居中，核较大，多为单核仁，部分可见双核仁(图2C)，其形态与ESCs不同，与人角膜上皮细胞形态相似。

图2 不同阶段光镜下细胞形态(标尺=100 µm)A：ESCs；B：拟胚体；C：诱导第7天的细胞；D：诱导第10天的细胞；E：诱导第15天的细胞；F：诱导第20天的细胞Fig.2 Cell morphology images at different stages under light microscope (bar=100µm)A: ESCs; B: embryonic bodies; C: induced cells on day 7; D: induced cells on day 10; E: induced cells on day 15; F: induced cells on day 20

2 诱导后细胞表达CECs特征性标志物mRNA为检测细胞基因表达是否发生变化，分别取ESCs和诱导10 d、15 d和20 d的细胞，用RTqPCR法检测干性标志物OCT4和SOX2、角膜上皮祖细胞标志物ΔNp63、角膜上皮前体细胞标志物CK14、角膜上皮标志物CK3和CK12的表达。结果显示(图3)，相比原代ESCs，诱导后的细胞OCT4和SOX2表达明显下调(P＜0.01)，而ΔNp63、CK14、CK3和CK12表达均逐渐上调，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

图3 ESCs和诱导细胞相关标志物mRNA的表达(aP＜0.05，bP＜0.01，vs ESCs)Fig.3 mRNA expressions of related markers in ESCs and induced cells (aP＜0.05, bP＜0.01, vs ESCs)

3 诱导后细胞表达CECs特征性标志物蛋白 分别对ESCs和诱导20 d的细胞进行免疫荧光染色，观察OCT4、ΔNp63和CK3的表达情况(图4)，可以看出，ESCs高表达OCT4，不表达ΔNp63和CK3。与之相反，诱导后的细胞不再表达OCT4，开始表达ΔNp63和CK3，进一步从蛋白水平验证了RT-qPCR的结果，说明诱导分化后的细胞为角膜上皮样细胞。

图4 共聚焦显微镜下ESCs和诱导细胞相关标志物的表达(标尺=75 µm) A：OCT4；B：ΔNp63；C：CK3Fig.4 Expressions of related markers in ESCs and induced cells under confocal microscope (bar=75 µm) A: OCT4; B: ΔNp63; C: CK3

讨 论

研究显示，体外培养的LSCs移植治疗LSCD，可有效改善患者的眼表状态，提高视力，能够取得良好的临床效果[3]。目前FDA批准的可用于临床治疗LSCD的细胞，来源于自体/异体角膜缘上皮细胞及自体口腔黏膜细胞。但在临床应用中发现，口腔黏膜上皮细胞移植术后易出现持续上皮缺损，抑制角膜新生血管的能力也较差，因此LSCs是移植的最佳细胞来源。角膜缘组织及LSCs供体来源缺乏，且异体移植依赖长期的免疫抑制治疗，因此，LSCs的来源对于双眼LSCD患者仍是棘手问题。

近20年来，大量基础研究试图将多种来源的细胞，如角膜缘、结膜、毛囊、牙髓、骨髓间充质干细胞、口腔黏膜、鼻黏膜上皮细胞、iPSCs及hESCs等用于LSCD的眼表重建，并取得了一定的治疗效果[4-5]。近年来，诱导hESCs分化为各种成体干细胞并应用于临床治疗的相关研究成为热点。2012年，hESCs来源的视网膜色素上皮移植治疗Stargardt病及干性年龄相关性黄斑变性的研究，证明了此方法的安全性。

2007年，Ahmad等[6]首次通过体外模拟LSCs微环境的方法，利用Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白、纤连蛋白及人角膜缘成纤维细胞将hESCs成功诱导为角膜上皮样细胞，并检测了相关标志物的表达。随后，不同研究通过条件培养基的方法[7-8]，将人类多能干细胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)培养于角膜缘成纤维细胞或LSCs培养基[9]，或以PA6基质细胞作为饲养层细胞共培养[10]，或培养于由去上皮的角膜Bowman膜构建的组织工程材料[11]，或分步培养于不同分化培养基等[12]，也成功分化出角膜上皮细胞。但这些诱导过程多较为烦琐，常需同时培养多种细胞，诱导周期长，成本较高。小分子化合物无动物血清，具有方便、多样和安全等特点，可高效而精准地对特定基因进行调控，便于推广[13]。研究表明，通过阻断BMP信号通路，激活FGF信号通路可诱导hESCs向晶状体祖细胞分化[14]。Src家族激酶抑制剂可通过下调经典Wnt通路，促进hPSCs向上皮分化[15]。TGF-β通路的小分子抑制剂可促进iPSCs向外胚层分化[16]。SB431542作为TGF-β通路的抑制剂，可促进hESCs向人角膜上皮前体细胞分化[13]。相比SB431542，SB505124可更高效地选择性抑制TGF-β和激活素信号通路[17]。以上研究均说明小分子化合物在诱导多能干细胞分化方面发挥着重要作用。胚胎发育过程中，CECs来源于体表外胚层，尽管许多发育机制和信号通路尚不清楚，但阻断TGF-β和Wnt通路在眼表/外胚层发育中是必须的[18]。IWP-2是经典Wnt信号通路的抑制剂[19]。近年来，研究多采用小分子化合物与微环境相结合的方法对hPSCs进行诱导。2014年，Mikhailova等[20]将SB505124、IWP-2和bFGF与Ⅳ型胶原蛋白联合，成功诱导iPSCs为类角膜上皮细胞。2016年，Wang等[21]采用维甲酸、SB505124和IWP-2联合明胶获得ESC-CECs，并证明了其免疫原性较低。2017年，Hongisto等[22]采用SB505124、bFGF和BMP-4联合纤连蛋白及Ⅳ型胶原蛋白诱导hPSCs分化为LSCs。本研究采用了ESCs的经典方法与小分子化合物(SB505124和IWP-2)结合，首先采用AggreWell孔板法获得具有向内、中、外3个胚层分化潜能的拟胚体，再利用SB505124和IWP-2阻断TGF-β和Wnt信号通路，同时联合bFGF激活FGF通路，使细胞逐渐向着外胚层、体表外胚层及角膜上皮方向分化，成功获得细胞形态与角膜上皮细胞相似、可表达特征性角膜上皮标志物CK3和CK12的角膜上皮样细胞。这种方案的诱导方法较此前研究有所简化，只用了SB505124和IWP-2两种小分子化合物，且诱导效率不低于其他方法。后续研究我们将诱导获得的角膜上皮样细胞作为种子细胞，构建角膜植片，移植于碱烧伤LSCD小鼠模型进行体内实验，对获得的角膜上皮样细胞功能进行进一步评价。