LINC00087靶向miR-519d-3p对胶质瘤细胞增殖凋亡的影响

刘恩智 邵晓光 盛巍 李勐

胶质瘤(glioma)是常见的原发性颅内恶性肿瘤，其中胶质母细胞瘤是最恶性的形式(WHO IV级)，并以治疗耐药性而臭名昭著[1]。发现胶质瘤的抑制基因，开发更为个性化的精准靶向治疗方法对胶质瘤患者的治疗具有重要意义[2]。研究表明，长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)可能与微小RNA(microRNA，miRNA)相关作用，通过MAPK、p53、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR和上皮间质转化(EMT)等信号通路的激活参与了胶质瘤的生长和进展[3]。研究表明，长基因间非编码RNA00087(LINC00087)在神经胶质瘤组织中高表达，可能是疾病的预后指标或治疗靶点[4]。本研究通过TargetScan预测发现，miR-519d-3p与LINC00087存在结合位点。miR-519d-3p在胶质瘤组织和细胞系中的表达显著降低，miR-519d-3p的过表达抑制细胞增殖并诱导细胞周期G0/G1期阻滞[5]。但LINC00087和miR-519d-3p在胶质瘤中的关系目前还尚不清楚。本研究检测胶质瘤组织中LINC00087的水平，然后以人胶质瘤细胞系U251为主要研究对象，检测LINC00087和miR-519d-3p对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 一般情况：选取2018年1～12月于我院病理检查确诊为胶质瘤的患者手术切除的胶质瘤组织共45例，其中男25例，女20例；年龄19～69岁，平均年龄(46.0±12.2)岁；病理级别：WHO Ⅰ～Ⅱ级24例，Ⅲ～Ⅳ级21例。患者术前未接受放疗和化疗。同时选择40例志愿者(脑外伤行颅内减压手术患者)正常脑组织作为对照。

1.1.2 仪器与试剂：人胶质瘤细胞株U251购自美国ATCC；胰蛋白酶、RNA提取试剂Trizol购自美国Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培养液培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，Real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；CCK8检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；引物、LINC00087抑制物(si-LINC00087)、miR-519d-3p模拟物(miR-519d-3p)、miR-519d-3p抑制剂(anti-miR-519d-3p)、阴性对照(si-NC、miR-NC和anti-miR-NC)、LINC00087野生型和突变型双荧光素酶报告载体均购自上海吉玛制药有限公司；Ki67、Caspase3和GAPDH抗体购自美国Santa cruz公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将胶质瘤细胞U251常规复苏，然后接种培养在含10% FBS的DMEM高糖培养液中，培养液中添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，然后置于37℃ 5% CO2培养箱中培养，消化传代。

1.2.2 Real-time PCR检测LINC00087和miR-519d-3p的表达:用Trizol试剂提取胶质瘤组织样本、正常脑组织及U251细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，再以cDNA为模板按照Real-time PCR的说明书进行反应，合成lncRNA LINC00087和miR-519d-3p。引物如下：LINC00087上游： 5’-GTCCCAAGTCTCCTGAGAAC-3’,下游5’-CCAGCTCTGTATCACTCTTG-3’；GAPDH上游：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,下游：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-519d-3p上游：5’-GACCAAAGTGCCTCCCTTTA-3’，下游：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游： 5’-AACGCTTACGAATTTGCGT-3’。应用2-ΔΔCt方法进行分析。

1.2.3 细胞转染:将U251细胞稀释为2×106个/ml，以100 μl细胞/孔的密度接种于6孔板中，细胞培养至融合度达到70%时，根据转染说明书转染U251细胞。将si-NC、si-LINC00087、miR-NC、miR-519d-3p、si-LINC00087+anti-miR-NC、si-LINC00087+anti-miR-519d-3p分别转染至U251细胞，分别为：si-NC组、si-LINC00087组、miR-NC组、miR-519d-3p组、si-LINC00087+anti-miR-NC组、si-LINC00087+anti-miR-519d-3p组。转染48 h，收集细胞进行验证。

1.2.4 CCK8实验检测细胞增殖:收集并稀释对数生长期的U251细胞，以2×103个细胞/孔(以100 μl细胞)接种于96孔板中，在37℃ 5% CO2培养箱中培养，在培养至48h时每孔加入10 μl CCK8溶液，培养2 h，酶标仪测定450 nm 吸光度(A)值。存活率%=实验组A组/对照组A值×100%。

1.2.5 Western Blot实验检测蛋白:收集转染后的各组U251细胞，裂解后提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度。用SDS-PAGE分离蛋白样本，转PVDF膜，然后将膜室温封闭1 h，洗膜后分别加入稀释的一抗，Ki67抗体(1∶1 000)、Caspase3抗体(1∶2 000)和GAPDH抗体(1∶4 000)，4℃过夜孵育。洗膜2次，然后加入稀释的酶标二抗，室温孵育2 h，显影，拍照。以GAPDH为内参照，分析蛋白表达水平。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率:收集各组转染的U251细胞，稀释为1×106个细胞/管，按照凋亡试剂盒说明书进行操作，加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl碘化丙啶(PI)混匀，室温避光15 min，上流式细胞仪检测检测细胞凋亡率。

1.2.7 双荧光素酶报告实验:根据1.2.3的方法进行细胞转染，将构建好的LINC00087的野生型(WT-LINC00087)和突变型(MUT-LINC00087)双荧光素酶报告载体，分别与miR-NC或miR-519d-3p共转染U251细胞，转染48 h后，收集并裂解细胞，离心收集裂解上清，根据试剂盒说明书检测荧光素酶相对活性。

2 结果

2.1 LINC00087在胶质瘤组织中的表达 与正常脑组织相比，胶质瘤组织组中的LINC00087水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 lncRNA LINC00087在胶质瘤组织中的表达

2.2 抑制LINC00087对U251增殖的影响 胶质瘤U251细胞中转染si-LINC00087抑制LINC00087的表达，si-LINC00087组的胶质瘤U251细胞中LINC00087含量降低，细胞存活率和增殖蛋白Ki67含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。说明抑制LINC00087可以抑制U251细胞增殖。见表2，图1。

表2 抑制LINC00087对U251增殖的影响

图1 Ki67蛋白的表达

2.3 抑制LINC00087表达对胶质瘤U251细胞凋亡的影响 si-LINC00087组的U251细胞中Caspase3蛋白表达量增多，细胞凋亡率升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。说明抑制LINC00087可促进U251细胞凋亡。见图2，表3。

图2 抑制LINC00087对U251凋亡(A)及Caspase3蛋白表达(B)的影响

表3 抑制LINC00087对U251凋亡的影响

2.4 LINC00087靶向调控miR-519d-3p的表达 TargetScan预测发现，lncRNA LINC00087与miR-519d-3p之间存在互补的位点。双荧光素酶报告实验结果表明，过表达miR-519d-3p组共转染野生型WT-LINC00087报告载体的细胞荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)；而共转染突变型MUT-LINC00087的细胞荧光素酶相对活性无显著变化。qRT-PCR结果表明，抑制lncRNA LINC00087可上调miR-519d-3p含量(P<0.05)。说明lncRNA LINC00087靶向负调控miR-519d-3p的表达。见表4、5，图3。

表4 双荧光素酶报告实验

表5 lncRNA LINC00087调控miR-519d-3p的表达

图3 LINC00087靶向miR-519d-3p

2.5 抑制miR-519d-3p表达逆转了抑制LINC00087表达对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的作用 为确认LINC00087通过调控miR-519d-3p影响胶质瘤细胞U251的增殖和凋亡，在抑制LINC00087的同时抑制miR-519d-3p。与si-LINC00087+anti-miR-NC组相比，si-LINC00087+anti-miR-519d-3p组的U251细胞中miR-519d-3p的含量降低，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低，Ki67蛋白含量升高，Caspase3蛋白含量降低，均具有统计学意义(P<0.05)。说明抑制miR-519d-3p可逆转抑制LINC00087对U251细胞增殖和凋亡的影响。见表6，图4。

表6 抑制miR-519d-3p表达逆转了抑制LINC00087对细胞U251增殖和凋亡的影响

图4 U251凋亡(A)及Caspase3蛋白表达(B)的影响

3 讨论

胶质瘤是是中枢神经系统中最具侵袭性的脑肿瘤，转移和扩散能力较高，高级胶质瘤患者总生存期大约只有15个月[6]。大量研究表明，包括lncRNA和miRNA在内的非编码RNA在胶质瘤的发生、发展及肿瘤分型中发挥关键作用[4-8]。

有研究表明，基因间lncRNA LINC00087在胶质瘤组织中表达呈现显著上调，且其表达水平在高级别胶质瘤组织中明显高于低级别胶质瘤组织，说明LINC00087可能是与患者预后有关的生物标志物[4]。但是笔者发现其在胶质瘤中的作用机制尚不清楚，在别的癌症中的研究较少。本研究通过检测45例胶质瘤组织和正常脑组织发现，与正常脑组织相比，LINC00087在胶质瘤组织中含量显著升高，与上述结果[4]一致；在胶质瘤U251细胞中转染si-LINC00087抑制LINC00087表达，结果发现，LINC00087含量降低后，胶质瘤U251细胞中增殖蛋白Ki67含量降低，细胞存活率降低，细胞凋亡率和凋亡蛋白Caspase3水平均升高，说明抑制LINC00087可抑制U251细胞增殖并促进细胞凋亡。

此外，本研究通过TargetScan预测发现，miR-519d-3p与LINC00087存在互补的位点，说明LINC00087与miR-519d-3p之间可能是靶向结合关系。双荧光素酶报告系统和qRT-PCR实验结果表明，LINC00087靶向负调控miR-519d-3p的表达。miR-519d-3p在乳腺癌[7]、胃癌[8]、前列腺癌[9]、结直肠癌[10]和胰腺癌[11]等组织或细胞中表达显著下调，发挥肿瘤抑制因子的作用，上调其表达可靶向不同的基因抑制癌细胞的增殖和侵袭。研究发现，miR-519d-3p在胶质瘤中表达下调，靶向细胞周期蛋白D1(CCND1)调控癌细胞的增殖和细胞周期进程[5]。本研究中还发现，抑制LINC00087可上调miR-519d-3p含量，说明miR-519d-3p和LINC00087在胶质瘤细胞中表达呈负向关系。进一步实验发现，抑制miR-519d-3p可逆转抑制LINC00087对U251细胞增殖和凋亡的影响，间接验证了在胶质瘤U251细胞中LINC00087对miR-519d-3p的调控关系。

综上所述，在胶质瘤组织中LINC00087上调，在胶质瘤U251细胞中，LINC00087靶向miR-519d-3p调控U251细胞增殖和凋亡。 LINC00087是胶质瘤的潜在分子靶点。