NLRP3基因多态性与汉族男性原发性痛风的关系

迪丽拜尔·阿吉木 王宇婷 叶 飞 苗 蕾

痛风是一种以嘌呤代谢障碍、血尿酸增高引起的代谢性疾病，痛风患者常伴发高血糖、高血压、高血脂、肥胖等多种疾病。近年来随着人民生活水平的提高，饮食习惯和饮食结构的改变，痛风的发生率呈逐年增长趋势，并且呈年轻化趋势，严重危害患者的身体健康[1]。研究发现，饮酒和富含高嘌呤饮食是男性痛风发作的主要诱因之一。30多年来,不论是欧美国家还是亚洲国家,痛风和高尿酸血症发生率均有明显增长[2,3]。目前全球痛风发生率为0.1%～10.0%,而我国痛风发生率约为2%[4]。美国人群痛风的发生率约为3.9%，法国为0.9%，英国为1.4%～2.5%，德国为1.4%[5]。

血清尿酸盐浓度的升高是痛风性关节炎最危险的因素之一，导致尿酸单钠(MSU)晶体沉积，主要沉积在周围关节内和周围组织，损害关节。血清尿酸盐浓度的升高与环境因素及遗传因素相关[6]。环境因素包括摄入啤酒、肉类和海鲜等富含嘌呤的食物，摄入会增加嘌呤核苷酸降解的果糖，自身的体重指数(BMI)过高以及有利尿药物服用史，最终导致尿酸产生过剩[7]。多项研究显示，遗传因素在原发性痛风中具有重要作用，并且已经发现20余个遗传易感位点[8～10]。NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含热蛋白结构域亚成员，被证明参与慢性感染炎症性疾病的先天免疫反应[11]。本研究中笔者将290例汉族男性痛风患者和302例健康对照者作为研究的对象，评估了痛风组和健康对照组NLRP3基因3种常见的单核苷酸多态性(SNP:rs35829419、rs7525979和rs3738448)的基因型和等位基因频率分布，并分析此位点的多态性是否与痛风的发病相关。

对象与方法

1.研究对象：痛风组(n=290)：本研究中痛风组患者均来源于2018年1月～2020年12月在新疆医科大学第四附属医院各门诊就诊病例和住院的汉族男性病例。已按照国际风湿病协会(2015年)分类标准确诊为痛风，并且所有的痛风病例均为汉族男性，患者平均年龄为48±13岁[12]。健康对照组来源于2018～2020年新疆医科大学第四附属医院门诊和体检中心的健康体检者302例，平均年龄为45±11岁，受试者均为汉族男性，无全身性炎症病史并排除关节炎史，无糖尿病、肾病、高血压、血脂异常和心脏病等病史，并事先征得每位患者的书面知情同意书，本研究得到新疆维吾尔自治区中医医院医学伦理学审查委员会的批准。

2.DNA提取：过夜禁食后，在研究对象知情同意的情况下采集研究对象的空腹外周静脉血样5ml，将2ml血样收集在进行过抗凝处理的乙二胺四乙酸(EDTA)试管中，使用DNA提取试剂盒从血液样本中提取DNA,并在-80℃下保存直至使用，剩余的3ml离心后进行生化检测。

3.NLRP3基因位点SNP分型(rs35829419、rs7525979、rs3738448)：采用上海天昊生物科技有限公司的SNPscanTM分型试剂盒对592个样本3个SNP位点进行基因位点分型，采用连接酶连接反应(ligase chain reaction,LCR)的高特异性对SNP位点基因型和等位基因进行识别，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列以及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，通过荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后经过对电泳图谱的分析获取各个SNP位点的基因型。

4.生化指标实验室检查：取空腹静脉血3ml，使用日立7600全自动生化分析仪测量尿酸(SUA)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖(FBG)、高密度脂蛋白(HLD)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(Cr)、血清葡萄糖(GLU)等，所有的检测均在新疆医科大学第四附属医院检验科进行。

5.统计学方法：用Epidata软件对问卷资进行录入，使用SPSS 20.00统计学软件对数据进行统计分析。计量资料组间比较采用t检验。计数资料组间比较用χ2检验，采用单因素Logistic回归分析计算比值比(OR)和95%置信区间(CI)评估NLRP3基因多态性与痛风性关节炎风险因素之间的关联。用SHEsis在线软件对每个SNP进行Hardy-Weinberg平衡性检验(HWE)，计算两组基因频率和等位基因频率及评估病例组和对照组的基因型和等位基因比例是否达到群体遗传平衡。

结 果

1.临床生化指标的分析:痛风组血糖、尿酸、胆固醇、高密度脂蛋白、肌酐水平均明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组年龄、BMI、收缩压、舒张压、甘油三酯比较，差异均无统计学意义(P>0.05),详见表1。

表1 两组一般资料与生化指标比较

2.痛风发病相关的危险因素分析:将吸烟、饮酒、高血压、高血糖、肥胖、TG、TC和尿酸8个因素作为自变量引入回归分析发现吸烟、血糖和尿酸与痛风发病相关(P<0.05)，详见表2。

表2 痛风发病相关危险因素的 Logistic 回归分析结果

3.基因SNP的Hardy-Weinberg平衡性检验：对两组研究对象rs35829419、rs7525979和rs3738448这3个位点进行Hardy-Weinberg平衡性检验，分析结果显示，本研究对照组群体达到遗传平衡，具有群体代表性(P>0.05)，详见表3。

表3 NLRP3基因的Hardy-Weinberg平衡性检验

4.基因频率及等位基因频率分布情况比较：痛风组与对照组NLRP3基因rs35829419、rs7525979和rs3738448位点SNP位点基因型及等位基因频率分布比较，rs35829419、rs3738448位点基因型及等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，不能说明这2个位点对痛风的发生产生作用。rs7525979基因型及等位基因频率分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表4。

表4 痛风组与对照组NLRP3基因型及等位基因频率分布的比较[n(%)]

5.NLRP3 基因SNP位点连锁不平衡检验与单倍型分析:NLRP3的3个SNP位点之间连锁不平衡检验结果显示，rs7525979-rs3738448 处于LD(D′>0.8和r2>0.3被认为是显著LD)。对这3个SNP位点进行单倍型分析结果显示，常见的单体型为CCG、CCT和CTT占所有研究个体中观察到的单体型的99.5%。与HC受试者比较，GA病例中单倍型CTT的频率显著降低(P<0.05)，而CCT单倍型的频率显著增加(P<0.05)。携带CTT单倍型的个体发生GA的风险显著增加(OR=52.961，P<0.05)，而CTT单倍型是发生痛风的保护因素(OR=0.227，P<0.05),详见表5。

表5 NLRP3基因单倍型的分布及遗传风险的关系[n(%)]

结 果

国内外的流行病学研究资料均表明，痛风的患病率呈逐年升高趋势，并且与脂代谢紊乱、肥胖、糖尿病及心血管系统疾病等密切相关[13]。高嘌呤饮食如摄入过多海产品、动物内脏等或饮酒均能增加痛风的发生率[14]。本研究结果显示，对照组尿酸、胆固醇、高密度脂蛋白、肌酐水平与痛风组比较，差异有统计学意义，吸烟、血糖和高尿酸与痛风发病相关。通过NCBI数据库查找发现，人类的NLRP3基因位于1q44染色体上,由11个外显子组成，SNP位点共有1000多个。NLRP3炎性小体在痛风发作中通过IL-1β介导的炎症发生和扩增起关键的作用。作为痛风炎症发作时激活IL-1β的开关，MSU晶体通过活化NLRP3炎性小体，激活效应蛋白胱冬肽酶-1(caspase-1)，进而将无活性的白细胞介素-1前体(pro-IL-1β)剪切加工为成熟的IL-1β，从而引起炎性反应[15]。

研究显示，NALP3炎性体与阿尔茨海默病、肾脏疾病、痛风等非感染性炎症疾病有关[16]。一项针对中国人群开展的研究报告显示，NLRP3的rs10754558和rs10925019位点促进溃疡性结肠炎的发展[17]。研究发现，rs7525979位点位于核苷酸寡聚结构域，其多态性与美国罗克维尔市人群帕金森病有关[18]。本课题组前期的研究结果发现，rs10754558位点与痛风发病有一定的关联[19]。因此，笔者假设NALP3炎性小体中的功能性SNP可能参与原发性痛风的发生。

本研究以290例汉族男性痛风患者和302例健康体检者为研究对象，选取3个SNP位点进行分析，发现3个SNP位点中rs7525979CC基因型和C等位基因在痛风组的分布频率高于对照组，两组分布比较差异有统计学意义(P<0.05)。痛风组rs7525979-C等位基因的频率为95%，对照组为81.45%，差异有统计学意义(P=0.000)，提示C等位基因可能是痛风发病的危险等位基因。痛风组rs7525979-T等位基因的频率显著低于对照组，T等位基因可能是痛风发病的保护基因。痛风组携带rs7525979-CC基因型的频率高于对照组(P=0.000)，携带CC基因型的个体发生痛风的风险显著高于携带TT基因型的个体。rs35829419与rs3738448基因型和等位基因频率在痛风和对照组分布频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),不能说明这两个位点与痛风有关联。

进一步对rs35829419、rs3738448、rs7525979这3个位单倍型分析发现3个位点可形成ATT、CCG、CTT、CTG、CTT、ACG和ACT 7种单倍型，CCT单倍型痛风组的频率高于对照组(P<0.05)，而CTT单倍型痛风组的频率显著低于健康组(P<0.05)，携带CTT单倍型的个体发生痛风的风险较其他单倍型增加(OR=52.961)，而携带CCT单倍型的个体发生痛风的风险降低(OR=0.227)，CCT单倍型对痛风发生有保护作用。

综上所述，NLRP3基因rs7525979位点的基因多态性与痛风发病有关联，但是NLRP3基因rs35829419、rs3738448与痛风之间未发现关联。NLRP3炎性受体基因多态性位点与痛风是否有关联需要开展进一步的临床和遗传学研究，为将来在人群中进行早期发现、早期预防、开展临床基因治疗工作和基因芯片等方面的工作提供重要依据。