海藻酸钠对磷酸镁骨水泥的理化性质及生物相容性的影响

罗文娜 李 威 郭卫春

人体骨组织具有再生潜能，对于损伤程度较轻且少量的骨缺损，人体骨组织能够完成自我修复，但对于大块骨缺损，骨组织则难以完成自我修复[1]。临床上治疗大块骨缺损主要采用骨移植法。目前，骨移植材料主要包括自体骨、异体骨和人工合成骨[2]。自体骨是治疗大块骨缺损的“金标准”，但自体骨来源有限，供骨区易发生感染、出血和疼痛等并发症，从而限制其在临床上的使用。尽管异体骨来源相对广泛，但异体骨移植存在疾病传播和免疫排斥的风险[3,4]。为了克服这些局限性，人们开发了各种各样的人工合成骨用以治疗大块骨缺损[5]。

磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)与人体骨组织的无机物具有相似的化学成分，因而受到研究者的青睐[6]。尽管CPC具有良好的生物相容性，但它也存在一定的局限性，如固化时间过长、抗压强度较弱以及降解速度过慢[7]。磷酸镁骨水泥(magnesium phosphate cement, MPC)具有相对较高的力学性能和可控的降解速率等优势因而备受关注[8,9]。与CPC比较，MPC具有凝结快、早期强度高的优点，但MPC固化时间过快难以应用于临床[10]。

既往有研究者通过在反应体系中加入无机物或有机物对MPC进行改性以达到延长固化时间的效果，使其满足临床操作需求[4,11]。海藻酸钠(sodium alginate, SA)是从马尾藻或海带中提取出来的一种高分子有机化合物，目前对于SA改性MPC的研究鲜有报道。因此，本研究希望通过在反应体系中加入不同浓度的SA，调节MPC的固化时间至合适的范围，同时探讨SA对MPC的理化性能及生物相容性的影响。

材料与方法

1.材料与试剂：轻质氧化镁(MgO)、磷酸二氢钾(KH2PO4)购自天津致远化学试剂公司，海藻酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，成骨细胞MC3T3-E1购自国家生物医学实验细胞资源库，CCK-8试剂盒购自武汉塞维尔生物技术有限公司，鬼笔环肽购自碧云天生物技术研究所。

2.骨水泥的制备：MPC包括固相和液相，固相由重烧MgO和KH2PO4组成，MgO和KH2PO4以1.5∶1.0的摩尔比例混合而成，分别在固相中添加1.0%、2.5%和5.0%(质量分数)的SA粉末。重烧MgO由轻质MgO在1600℃煅烧3h获得。重烧MgO与KH2PO4在球磨仪中研磨后过200目筛处理，得到样品粉末并干燥保存。液相由去离子水组成。将固相液以2g/ml比例混合，均匀搅拌成糊状，随后将骨水泥转移至模具中制备不同大小的骨水泥样品。使用直径为6mm、高度为12mm的模具制备出圆柱状样品，用于理化性质检测；使用直径为6mm、厚度为1mm的模具制备出圆盘状样品，用于后续细胞实验。根据海藻酸钠含量的不同，将制备的骨水泥样品记为SA-MPC1, SA-MPC2.5和SA-MPC5，未添加海藻酸钠的MPC作为对照组。

3.骨水泥形貌检测：将制备的骨水泥样品置于37℃，100%湿度条件下养护2天。取出样品放入干燥箱内干燥，随后将样品放入离子溅射样品台上喷金30s，扫描电子显微镜观察样品形貌结构。

4.固化时间测定：根据国标GB/T1346-2001，采用维卡仪测定固化时间。测定时，试针垂直自由地沉入水泥浆体，观察试针读数。从固液相混合开始计时，到进入浆体的试针读数不超过1mm，该段时间即为固化时间。每组样品测试3次。

5.抗压强度测定：采用万用材料测试仪测量骨水泥的抗压强度。取出养护2天的样品，将样品两端磨平，然后用万用材料测试仪以1mm/min的加载速度测量骨水泥抗压强度。每组样品测试3次。

6.降解速率和pH值测定：将养护2天的骨水泥样品取出并烘干，记录其初始质量为M0。降解液为磷酸盐缓冲盐水(Tris-HCl, pH7.4)将骨水泥样品与降解液按照0.05g/ml比例置于无菌试管中，并放置于37℃恒温水浴箱中。在固定时间点(第1、3、7、14、21、28天)将骨水泥样品取出，去离子水清洗3次，60℃烘箱中干燥6h，随后测量样品重量并记录为M1。同时，用pH值仪测定溶液的pH值。每组样品测试3次。降解速率记为D=(M0-M1)/M0×100%。

7.细胞增殖检测：采用CCK8法评估MC3T3-E1细胞增殖情况。将制备好的圆盘状骨水泥样品用环氧乙烷灭菌，并放置在通风干燥处7天以去除残留的环氧乙烷气体。随后，将样品放置于96孔板内，缓慢加入配制好的培养基湿润样品。MC3T3-E1细胞以1×104的密度接种在样品表面上，置于37℃、5%CO2温箱中培养，每天更换一次培养基。在固定时间点(第1、3、5天)，向每孔加入10μl CCK-8溶液并将孔板在培养箱继续孵育2h。最后，从每孔中取出100μl培养基转移至新的96孔板中，96孔板在酶标仪中于450nm处测定吸光度。

8.细胞黏附检测：MC3T3-E1细胞在样品上培养5天后，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗样品，然后用4%多聚甲醛溶液固定4h，梯度乙醇脱水，真空干燥后喷金，扫描电子显微镜观察细胞黏附情况。

9.细胞形态检测：MC3T3-E1细胞在样品上培养5天后，4%多聚甲醛溶液固定15min, PBS清洗细胞3次，滴加0.1%TRITON，破膜20min。随后，滴加50μl鬼笔环肽工作液，室温孵育2h，PBS清洗3次，DAPI复染细胞核，避光室温孵育10min。激光共聚焦显微镜拍照观察细胞形态情况。

结 果

1.骨水泥形貌结构：通过扫描电子显微镜观察到，MPC表面有较多裂纹，裂纹大且宽。随着SA含量的增加，SA-MPC表面逐渐变得平滑，且裂纹逐渐变细变窄，微观结构逐渐变得致密，详见图1。

图1 骨水泥扫描电镜照片(×500)A.MPC;B.SA-MPC1;C.SA-MPC2.5;D.SA-MPC5

2.固化时间和抗压强度：随着反应体系中SA含量的增加，骨水泥的固化时间逐渐延长。骨水泥的固化时间由6.13±0.86min延长至16.43±1.50min(图2A)。骨水泥的抗压强度随着SA含量的增加呈现先上升后下降的趋势。MPC的抗压强度为16.26±1.04MPa， SA-MPC2.5的抗压强度最高，达到28.33±1.76MPa， SA-MPC5的抗压强度稍下降，为25.20±2.25MPa(图2B)。

图2 不同组分SA对固化时间和抗压强度的影响A.固化时间；B. 抗压强度。与MPC比较，*P<0.05

3.降解速率和pH值变化情况：各组骨水泥的降解速率随着时间延长逐渐增加，且添加SA的骨水泥降解速率均高于MPC组。随着SA含量的增加，降解速率呈现出逐渐上升的趋势。各组降解速率相似，差异无统计学意义(P>0.05,图3A)。各组骨水泥的pH值变化趋势相同，随着时间延长pH值逐渐上升，且前7天上升趋势更快，而后逐渐趋于平稳。此外，随着SA含量的增加，pH值呈逐渐下降趋势(图3B)。

图3 不同组分SA对降解速率和pH值的影响A.降解速率；B.pH值

4.细胞增殖：随着时间的延长，各组细胞数均呈现增长趋势，在实验第3天和第5天，SA-MPC2.5和SA-MPC5两组细胞数高于MPC组，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

图4 不同组分SA对细胞增殖的影响与MPC比较，*P<0.05

5.细胞黏附和形态：扫描电子显微镜结果显示，MC3E3-E1细胞在各组骨水泥表面上均能够黏附生长，但在添加SA后，细胞胞体变大，细胞伪足多且长，彼此物理接触较多(图5A)。激光共聚焦显微镜结果显示，各组细胞核未见明显异常，细胞铺展良好，与MPC组比较差异无统计学意义(图5B)。

图5 不同组分SA对细胞黏附和细胞形态的影响A.细胞黏附(×1000)；B.细胞形态(×200)

结 果

作为骨修复材料，固化时间是一个重要参考指标[12,13]。既要给临床医生提供足够的操作时间，又要在合适的时间内固化[14]。目前，对于固化时间的范围尚无统一标准，多数研究者认为固化时间控制在8～15min比较符合临床操作要求[15]。磷酸镁骨水泥的反应机制是基于酸碱中和的快速水化反应，其固化时间较短因而难以应用于临床。在本研究中，骨水泥的固化时间随着SA的含量增加而逐渐延长，当SA的添加量为2.5%(质量分数)时，骨水泥的固化时间延长至12min左右，介于上述范围内，能够满足临床操作需要。在本研究中SA起到了缓凝剂的作用，可能的原因是SA作为一种有机物，在加入到反应体系后能包裹在氧化镁的表面，延缓镁离子的释放速度，进而延缓酸碱中和反应速度。

作为骨组织填充材料，骨水泥需要有足够的抗压强度才能应用于人体负重骨组织中[16]。Sprio等[11]研究发现在掺锶磷酸钙骨水泥中添加海藻酸盐可以显著提高骨水泥的抗压强度。本研究中骨水泥的抗压强度随着SA含量的增加呈现出先上升后下降的趋势，其中SA-MPC2.5的抗压强度最高，达到28.33±1.76MPa。根据扫描电子显微镜结果，推测可能原因是SA能够填充在MPC的缝隙中，减少缝隙数量，使骨水泥的网络结构更加致密，从而引起抗压强度的增加。但当进一步增加SA添加量时，骨水泥的抗压强度却下降，可能原因是SA的强度在骨水泥中占据主导地位，从而导致抗压强度的下降。但对于SA如何影响抗压强度的变化仍需进一步探讨。

骨修复材料应具有生物可降解性，以便材料在降解的同时逐渐被新生骨组织替代[17]。本研究中各组骨水泥降解趋势相似，且随着SA含量的增加降解速率逐渐增加。可能原因为:①与MPC比较，SA具有相对较高的溶解度，这使得SA在Tris-HCl中更易于降解;②随着SA的降解，会在骨水泥中留下很多微小的孔洞，使水分子很容易进入到骨水泥的内部破坏微观结构，从而导致降解速率增加。pH值是影响细胞活性的重要因素，过酸或过碱的环境都不利于细胞的生长。MPC中由于含有未反应的MgO，会在溶液中形成Mg(OH)2，从而增加pH值，使溶液偏碱性。在本研究中，笔者发现SA的加入降低了溶液pH值，可能原因是SA含有大量羧基，能够释放出H+，进而降低pH值。因此，通过调整反应成分，能够获得不同降解速率和pH值的骨水泥。

良好的生物相容性是人体植入材料的一项必备条件[18]。理想的骨修复材料除了具有良好的生物相容性，还应具有刺激细胞和组织生长的生物活性。本研究采用CCK-8法评估骨水泥对细胞增殖的影响，结果提示各组骨水泥样品对细胞没有毒性，但添加SA后的骨水泥更有利于细胞增殖。此外，细胞黏附和形态结果显示，在添加SA的骨水泥上细胞胞体变大，伪足多且长，彼此物理接触较多，提示SA更加有利于细胞生长。以上研究结果显示，添加SA的骨水泥没有细胞毒性，且具有良好的生物相容性。

综上所述，SA可有效改善MPC的理化性能，能够调节MPC的固化时间至合适范围并使其具有理想的抗压强度，同时能够调节降解速率和pH值使其满足临床需求。此外，生物学实验表明SA改性的MPC具有良好的生物相容性，有潜在的临床应用价值。