氢吗啡酮预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤时PI3K/Akt的影响

张 郃，龙 超，杨 丽，张森兵，董文理

0 引言

肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是肾移植及心血管大手术后常引发的急性肾损伤的病理生理过程。经典的麻醉药物吗啡可在大鼠肾缺血再灌注损伤的实验中显示出药物预处理的保护作用[1]，氢吗啡酮是吗啡的半合成衍生物，镇痛效应是吗啡的10倍，且不良反应少，在前期研究发现，氢吗啡酮预处理减轻大鼠心肌[2]、视网膜[3]的缺血再灌注损伤。有研究证实，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路在RIRI中起着非常重要的调控作用[4]。本研究拟建立大鼠肾缺血再灌注模型，观察氢吗啡酮预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤中PI3K/Akt信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药品和试剂 氢吗啡酮注射液,宜昌人福药业有限责任公司生产；TNF-α、IL-6、MDA、SOD、酶联免疫吸附试剂盒，武汉赛格尔生物科技有限公司生产；Bax、Bcl-2 单克隆抗体，美国 Cell Signaling Technology 公司生产；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)抗体、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗体,上海信裕生物工程有限公司生产。

1.2 动物分组、给药方法及RIRI模型建立 健康雄性清洁级成年SD大鼠36只，体重180～220 g，于温度23 ℃、湿度50%环境下饲养。实验动物由湖北科技学院动物实验中心提供，动物合格证号：SYXK(鄂)2018-0016。所有大鼠实验前禁食12 h。SD大鼠随机分为3组：假手术组(S组)、缺血再灌注组(IRI组)和氢吗啡酮预处理组，每组12只。造模前25 min实验组大鼠腹腔注射氢吗啡酮30 μg/kg，其余两组注射等量生理盐水。腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后，常规消毒铺巾，三组大鼠背部肾区切口，钝性分离肌肉组织和肾筋膜，分离双侧肾动脉，S组大鼠只分离双侧肾动脉但不夹闭，其余两组夹闭双侧肾动脉至肾脏颜色变为苍白，缺血45 min时松开动脉夹，恢复肾脏灌注至肾脏颜色变为鲜红，制备缺血再灌注模型。于再灌注24 h后处死大鼠，取肾组织及血样本。

1.3 HE染色法观察各组IRI大鼠肾组织病理形态 各组随机取4只大鼠左肾上极组织，10%福尔马林固定24 h，随后依次进行酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。选取包含左肾上极组织的纵切面切片，切片厚度为5 μm，行常规HE染色。每组取5张切片进行观察，光学显微镜下，每张切片随机取5个视野(400×)进行观察并拍照。

1.4 ELISA法检测血BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD水平 各组随机取4只大鼠血清2 ml，室温静置20 min，6 000 r/min离心5 min，取上清。参照ELISA试剂盒说明，全自动生化分析仪测定血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量。

1.5 Western blot法测定肾组织Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表达 各组随机取4只大鼠肾组织裂解提取蛋白，测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离目的蛋白。冰浴转膜后，脱脂奶粉室温封闭1～2 h。加入Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt抗体，4 ℃孵育过夜。二抗孵育1 h后TBST清洗，显色曝光，扫描 胶片，BandScan软件分析条带灰度值。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织病理形态改变 S组肾小管、基底膜及刷状缘结构完整，清晰可见；IRI组肾小管肿胀明显，基底膜及刷状缘缺失或脱落，可见空泡状坏死，肾间质水肿明显，并可见大量中性粒细胞浸润；与IRI组相比，H组肾小管、基底膜及刷状缘结构相对完整，空泡状坏死减少，肾间质水肿不明显，仅见少量中性粒细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠肾组织HE染色典型照片(400×)

2.2 各组大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量 与S组比较，IRI组和H组BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA含量均明显升高，SOD含量均明显降低(P<0.05)；与IRI组比较，H组BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA含量均明显降低，SOD含量明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量

2.3 各组大鼠肾组织Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表达比较 与S组比较，IRI组及H组 Bax、p-PI3K、p-Akt相对表达量均明显升高，Bcl-2明显降低(P<0.05)；与IRI组比较，H组Bcl-2、p-PI3K、p-Akt相对表达量均明显升高，Bax明显降低(P<0.05)。见图2。

图2 大鼠肾组织Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表达

3 讨论

近年研究发现，吸入类[5]、右美托咪定[6]等麻醉药物可在大鼠肾缺血再灌注损伤的实验中显现出预处理后的保护作用。既往的基础研究表明，阿片受体激动剂预处理在肾缺血再灌注损伤模型中的保护作用机制多与激活了阿片受体有关，主要通过启动减弱炎症级联反应、减少氧自由基生成、抗凋亡挽救激酶信号途径等方式得以实施[1,7]。

氢吗啡酮是一种强效的阿片类镇痛药，在RIRI模型中是否具有类似效应，还需进一步证实。本研究发现，氢吗啡酮预处理后，RIRI模型大鼠肾小管无明显肿胀，间质水肿较少，刷状缘较整齐，空泡变性坏死轻微，提示氢吗啡酮可减轻RIRI的肾组织病理损伤。本研究还发现，IRI组大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、Bax升高，SOD、Bcl-2下降，其肾功能受损、炎性反应、氧化应激及细胞凋亡程度均较S组加重，而采用氢吗啡酮预处理后，上述症状和指标均有明显改善，说明氢吗啡酮可在肾缺血再灌注损伤的过程中发挥抗炎、抗氧化应激及抗凋亡的保护作用。

经典PI3K/Akt信号通路的研究在RIRI模型中，其主要病理过程为外界刺激和(或)创伤促使PI3K的活化，加速其磷酸化转化为PIP3，进而诱导Akt的磷酸化，而活化的 Akt可调节炎性反应、氧化应激及细胞凋亡等过程[8]。有报道，吗啡[9]、舒芬太尼[10]等阿片类药物均可通过激活PI3K/Akt信号通路调节细胞凋亡因子的表达，从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡，也有研究表明，氢吗啡酮可通过调节Bax 及Bcl-2 表达抑制其凋亡，进而减轻其缺血再灌注损伤[11]。在肾缺血再灌注损伤模型的研究中，其他药物或保护措施也可通过激活PI3K/Akt信号通路，减少小鼠RIRI的TNF-α、IL-6表达水平，减轻炎症反应[12-13]；也可抑制肾内皮细胞氧化应激反应，并减少ROS的释放，调节SOD、MDA的表达，提高细胞存活率[14]；并可抑制促凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase等的形成，抑制肾细胞凋亡[15]，达到减轻肾缺血再灌注损伤的目的。本研究显示，IRI组及H组 p-PI3K、p-AKT含量均明显升高，且H组p-PI3K、p-Akt明显高于IRI组，说明氢吗啡酮也可通过激活PI3K/Akt信号通路，调节肾缺血再灌注损伤的程度。

本研究中，IRI组及H组的炎性反应、氧化应激及细胞凋亡水平均较S组增加，而采用氢吗啡酮预处理后，上述变化得以缓解，但p-PI3K、p-AKT的表达则相对升高，推测氢吗啡酮可通过激活PI3K/Akt信号通路，减轻肾缺血再灌注损伤过程中的炎性反应、氧化应激及细胞凋亡。

综上所述，氢吗啡酮可通过PI3K/Akt 信号通路调控炎症反应、氧化应激及细胞凋亡水平，减轻大鼠肾缺血再灌注损伤。