动脉球囊损伤大鼠Akt、GSK-3β表达及药物干预治疗

葛 华,潘龙庆,王天如,王 月,李立杰,周雪莹

0 引言

经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是目前治疗冠心病最为有效的方法之一。由于患者术后再狭窄的发生率高，严重影响了PCI的临床疗效。最初的球囊扩张术再狭窄率达到35%～50%[1]，随着金属裸支架及药物涂层支架的应用，再狭窄率有所下降[2]。因此，再狭窄的防治成为目前心血管领域防治研究的重要课题。研究证实，血管内皮损伤后，内皮细胞的增生移植是发生PCI术后再狭窄的重要病理生理基础[3]。厄贝沙坦是一种血管紧张素II受体拮抗剂(Angiotensin Ⅱ receptor blocker,ARB)，在逆转心室重构、降压等方面发挥重要作用。近年来的研究证实，ARB有抑制血管平滑肌增殖的作用[4]。

本研究以蛋白激酶B (Protein Kinase B,也称Akt)结合糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)为上、下游信号分子，研究再狭窄的发生机制，探讨厄贝沙坦与Akt、GSK-3β信号通路在血管内皮细胞增生中的相互关系，探析再狭窄信号通路的作用，为临床药物的治疗机制开拓新思路。

1 材料和方法

1.1 动物 雄性Wistar大鼠48只，体重300～350 g,由沈阳医学院动物中心提供。

1.2 方法 按照 Deman 等方法制备大鼠动脉血管形成术模型，戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉，消毒右侧腹股沟区，剪开皮肤及皮下组织，钝性分离肌层，暴露股动脉，远心端结扎，近心端用动脉夹夹闭，在结扎线上方剪一个J字口，插入自制 2F Forgraty 球囊导管，松开动脉夹，进入球囊约12 cm,插入至胸主动脉，肝素生理盐水充盈球囊，回拉球囊，在3个相隔120°的方向上各重复3次，拔出球囊导管，近心端结扎，逐层缝合，消毒。术后随机分为模型组、药物组，每组16只。厄贝沙坦50 mg/(kg·d) 溶于生理盐水，采取胃管给药，每日1次。模型组及对照组(n=16)予等量生理盐水灌胃。分别于第2周和第4周处死大鼠取材。

1.3 标本采集及处理 以10%KCl 2～3 ml 股静脉注射处死各观察终点大鼠，分离血管，于4%福尔马林固定24 h，取长约1～1.5 mm 的血管切片，用10%福尔马林固定，石蜡包埋。

1.4 Western blot测定Akt、GSK-3β蛋白水平表达 血管组织于冷冻的提取缓冲液(1∶3wt/vol) (成分：10 mM Tris HCl,pH7.5,140 mM NaC1,1 mM EDTA,25%Glvcerol,0.5%SDS,0.5% Nonidentp-40,0.1 mM PMSF,100 ng/ml Protease inhibitor cocktail)中行均质化处理(30 s.2 000 r/min),离心(4 ℃,10 min,14 000 r/min),Bio-Rad 蛋白分析仪(Bio-Rad company,USA) 测量上清液蛋白浓度，液氨速冻保存于-80 ℃。10%SDS-PAGE 分离10～20 μg蛋白于硝酸纤维素膜行蛋白印迹杂交。GSK-3β抗体(FabGennix) 、Phospho-ser473-AKT 和 AKT 抗体(New England Biolabs) 按说明书方法检测。应用二抗特异性 HRP-conjugated 抗体，其信号用 ECL detection kit (Amersham Pharmacia Biotech) 显示，AlphaEaseFC Software 处理并量化统计。为标准化不同的蛋白含量，利用剥脱液(stripping buffer:1.87 g glycin/1 L,100 ml 10%SDS/1 L,pH=2) 剥脱原始抗体复合物,并用GAPDH (primary antibody:Chemicon,MAB-374,1∶5 000;secondary antibody:Donkey anti-mouse,Dianova,1∶50 000)再杂交内对照。

2 结果

动脉球囊损伤术后2周和4周，手术组血管组织的Akt表达量较对照组明显升高，GSK-3β表达量较对照组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；厄贝沙坦治疗组Akt表达量较手术组明显降低，GSK-3β表达量较手术组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1、表2。

表1 各组大鼠成模后2周血管组织中Akt、GSK-3β蛋白表达比较

表2 各组大鼠成模后4周血管组织中Akt、GSK-3β蛋白表达比较

3 讨论

PCI术后再狭窄是多种因素综合导致的，主要有冠脉弹性回缩、血管重塑、血栓的形成、血管平滑肌细胞的过度增生及迁移[5]。植入支架可以干预弹性回缩、影响血管重塑，但不能抑制血栓形成及血管内皮细胞增殖，而血管内皮细胞的增殖是术后再狭窄形成的主要机制[6]。手术操作导致的血管内膜机械性损伤会使脂质、血小板及单核巨噬细胞等血液中的活性成分在损伤区域沉积，而且会引发血管平滑肌细胞的内迁及增殖[7-8]。血管内皮损伤后激活了大量的炎性细胞，聚集在损伤处并分泌出大量的生长因子、炎性因子(如血小板源衍生生长因子、胰岛素样生长因子、白介素-1、血栓素A2等)介导多个信号通路，参与了血管狭窄的过程[9]。血管紧张素转换酶也具有促进血管平滑肌细胞增殖的作用[10]。

本研究通过构建大鼠球囊损伤模型，发现术后血管组织中Akt表达量较对照组明显升高，GSK-3β表达量较对照组明显降低，提示GSK-3β可能是一种血管保护因子，而Akt可能是血管内皮增生的独立影响因子。应用厄贝沙坦干预后，药物组Akt表达量较模型组明显降低，GSK-3β表达量较模型组明显升高。结果表明，厄贝沙坦可能是通过激活Akt/GSK-3β信号通路从而参与抑制血管内皮增生。

PI3K 在人体各种细胞中广泛存在，是介导细胞内信号转导的重要存在，与细胞凋亡密切相关。Akt是反转录病毒Akt-8 的癌基因 v-akt 编码的产物，是PI3K 下游的最直接的信号分子。研究表明，Akt 被激活后，会转运至细胞质和细胞核，磷酸化后激活下游信号靶点产生生物学效应，可以对心脏产生保护作用[11-12]。GSK-3β为一种丝氨酸/苏氨酸酶，是Akt下游的一个直接作用底物。它在许多代谢和生理过程中发挥重要作用，已被证实参与调节细胞凋亡[13]，此外，GSK-3β还促进cyclinD蛋白水解[14]。研究表明，PI3K/Akt信号通路能够通过刺激血管内皮细胞迁移和参与血管形成等多种机制影响心脏功能[15]。最近研究发现，Akt能够通过抑制GSK-3β的表达而增加cyclinD，并促使内皮细胞进入增殖周期[16]。PI3K/Akt信号通路是细胞内非常重要的生存通路，Akt信号通路能发挥调控细胞生长、增殖和凋亡的重要作用，在维持细胞生存中发挥重要作用[17]。厄贝沙坦是ARB类药物，通过特异性拮抗转换酶受体，抑制血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，降低细胞氧化自由基的含量，发挥内皮细胞稳定作用，还同时抑制醛固酮和血管收缩素的含量，从而抑制血管收缩、解决水钠潴留[18]。有研究通过过度表达Notch1抑制血管内皮细胞增殖,同时发现AngII的表达减少[19]，表明厄贝沙坦有抑制血管内膜损伤后的增生、降低术后再狭窄的作用[20]。

细胞信号转导途径在再狭窄中的作用越来越受到研究者的重视，本研究从信号转导途径，以Akt结合GSK-3β研究再狭窄的机制，为再狭窄防治提供理论依据。结果表明，应用厄贝沙坦干预治疗使术后再狭窄患者的防治成为可能，具有较好的应用前景。