基于GC-MS八角枫对大鼠的肝脏代谢组学研究

茅银燕，江夏娟，仝淑花，林崇良*

0 引言

中药材八角枫[Alangiumchinense(Lour.)Harmssubsp.Chinense]，来源于八角枫科(Alangiaceae)八角枫属(Alangium)植物[1]，广泛分布于中国南方地区。八角枫的根、根皮、叶、花、皮[2]等均可入药，茎民间称为白龙条，须根民间称为白龙须，可用于治疗风湿、跌打损伤、外伤等[3-5]，临床使用中主要以须根为主。中成药制剂主要有风湿定片、胶囊[6]等。八角枫是一种有毒的中药材，毒藜碱是八角枫的主要毒性成分，其中毒机制[7-9]为肌肉松弛作用和呼吸肌麻痹。本文应用代谢组学方法，探究八角枫对肝脏代谢的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SD大鼠，(200±20)g，32只大鼠均饲养于温州医科大学实验动物研究中心。动物使用许可证号：WYDW2019-0983。

1.1.2 试剂与药品 三甲基氯硅烷(TMCS)、N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)、甲基羟基胺盐酸盐和吡啶(纯度>98%)购自美国Sigma公司。HPLC级乙腈和正庚烷购自美国Merck公司。八角枫采自浙江省永嘉县，经温州医科大学附属第一医院林崇良副主任中药师鉴定为八角枫。取其须根20 g，加水200 ml，常压下100 ℃水煎煮30 min，过滤，制备成八角枫煎煮液备用，0.1 g/ml。八角枫煎煮液经处理后UPLC-MS/MS定量检测，含有毒藜碱39.5 μg/ml和水杨苷12.5 μg/ml。

1.1.3 仪器 GC-MS气相色谱-质谱仪型号为6890N-5975B(美国Agilent公司)。色谱柱为HP-5 MS(0.25 mm×30 m，0.25 μm)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验 八角枫药材分须根(直径1 mm)、粗根(支根或侧根，直径3～5 mm)，须根毒性强，粗根毒性稍弱，主要有效成分为毒藜碱和水杨苷，水煎服成人用量为0.3～3 g，按比例换算大鼠每日剂量。将大鼠分为4组，每组8只。对应剂量具体分为对照组和3个剂量组：八角枫低剂量组0.25 g/kg、中剂量组0.5 g/kg、高剂量组1.0 g/kg。对照组口服1 g/(kg·d)生理盐水14 d；八角枫低剂量组0.25 g/(kg·d)，八角枫中剂量组0.5 g/(kg·d)，八角枫高剂量组1.0 g/(kg·d)，均口服给药14 d。第15天上午8∶00收集四组大鼠肝样本，储存于-80 ℃直至测量。

1.2.2 样品制备 将大鼠处死后收集肝组织研磨至匀浆。将400 μl乙腈加入到100 μl肝匀浆中，涡旋1 min，在4 ℃下以10 000 g持续离心10 min。取上清液300 μl转移到离心管中，氮气吹干。再加入甲基羟胺盐酸盐(15 mg/ml吡啶溶液)50 μl，70 ℃甲肟化24 h。加入MSTFA(含1%TMCS作为催化剂)50 μl保持70 ℃ 1 h，加入150 μl正庚烷，离心取100 μl上清液保存，待测。

1.2.3 仪器条件 采用EI模式，在电子能量为70 eV、m/z50～550，使用全扫描模式，进样选择不分流模式。柱温箱的初始温度设定在80 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min速度持续升温至300 ℃，保持5 min。

1.3 数据分析 SIMCA-P 13.0软件(Umetrics，Umea，瑞典)，通过主成分分析(PCA)和PLS-DA处理由GC-MS所检测的数据。根据 SIMCA-P13.0软件中正常组与模型组的变量权重(Variable importance in the projection，VIP)，筛选出 VIP>1的变量，进一步行非参数检验。应用SPSS 18.0软件，用独立样本t检验检测两组间代谢物的差异，P<0.05为差异统计学意义。

1.4 代谢标志物寻找及代谢通路分析 NIST2008标准谱库检索，结合使用KEGG数据库 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)确定相关代谢生物标志物，导入MetaboAnalyst进行代谢通路分析。

2 结果

相同保留时间下，对照组与剂量组丰度差异明显，血浆代谢物特征峰的保留时间和离子丰度值稳定，这表明在数据采集过程中气质仪运行稳定可靠。

2.1 PCA与PLS-DA分析结果 从八角枫组3个剂量组与对照组大鼠PCA的比较结果可见，分离效果不理想，各组间有明显的重叠，表明可能各组的肝脏代谢物难以明显区分，PCA-2D R2Y=0.175，PCA-3D R2X=0.302，R2Y=0.175，如图1所示。进一步使用PLS-DA得分图进行分析。PLS-3D评分图显示，八角枫的3个剂量组与对照组分别可以明显区分，且PLS-3D结果优于PLS-DA，随着剂量增加，在PLS-3D上位置也有不同程度偏移，PLS-2D R2Y=0.109，PLS-DA-3D R2X=0.235，R2Y=0.109，见图2。

图1 大鼠肝组织样品的PCA评分结果

图2 大鼠肝样品的PLS-DA评分结果

2.2 代谢标志物及其相对变化 图3为肝组织的典型GC-MS代谢谱。NIST 2005数据库检索组织中的内源性代谢物，共约90种小分子化合物，包括氨基酸类、有机酸类、脂肪酸类等，GC-MS方法学的重复性RSD小于15%[10]。

图3 大鼠肝样品的GC-MS图

本研究使用PLS-DA模型中的变量重要性投影(VIP)参数和独立样本t检验来评价内源性代谢物相对峰面积在对照组和剂量组之间的差异。只有同时满足VIP>1和P<0.05才被认为可能是潜在的生物标志物。按上述原则，共从八角枫对照组和3个不同剂量组的代谢产物的变化对照中，发现了12个内源性生物标志物，见表1。结果表明，八角枫组和对照组比较，N,N-二丁基乙酰胺(N,N-dibutyl-Acetamide)、甘油(Glycerol)、丙氨酸(Alanine)、木糖醇(Xylitol)、山梨醇(Glucitol)、9,12-十八碳二烯酸[(Z,Z)-9,12-Octadecadienoic acid]、4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)(4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid)、α-麦角甾烯醇(alpha.-Ergostenol)降低，丝氨酸(Serine)、磷酸(Phosphoric acid)、棕榈酸(Hexadecanoic acid)、D-葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid)升高。

表1 大鼠给予八角枫后血浆中代谢物的相对水平

2.3 代谢通路图的构建 将得到的生物标志物进行代谢通路分析，MetPA潜在目标代谢途径分析(影响值≥0.10)显示，八角枫影响肝代谢紊乱最密切的6条代谢途径是亚油酸途径(Linoleic acid metabolism)、抗坏血酸和醛酸代谢(Ascorbate and aldarate metabolism)、糖醛酸途径(Pentose and glucuronate interconversions)、甘油脂代谢(Glycerolipid metabolism)、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢(Glycine,serine and threonine metabolism)以及氨酰-tRNA合成(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)，见表2。不饱和脂肪酸在体内参与一系列氧化反应，能量水平的变化直接影响正常的生理代谢，这也反映在了代谢途径的变化中,表明八角枫可能导致机体糖脂代谢紊乱，主要是通过影响肝的脂质过氧化、氧化应激等途径来参与肝代谢。

表2 代谢通路及影响值

3 讨论

传统观念认为，中草药是安全有效的天然药物，不良反应比化学药物小，但相比西药，服用中草药及相关制剂引起的药物性肝损伤最为多发，而其中又以民间自用验方、单方制剂引起的药物性肝损伤比例最高[11-12]。中药成分繁多，药理活性复杂，剂型、剂量、配伍变化多变，这导致其不良反应难以预测且多发，也导致中药临床用药安全越来越被广泛关注。肝脏作为药物代谢最重要的器官，同时也是毒性反应最主要的靶器官，关于中药引起肝损伤的临床报道屡见不鲜。目前，有报道，引起肝脏损害的常用单味中草药约有50多种[13]，而民间用药品种更多且难以统计，中草药引起肝损伤的成分主要以生物碱类为主，引发的肝损伤发病数和社会危害程度已经成为不可忽视的问题[14]，这也严重限制了中医药的国际化发展。

张长银等[8]通过观察八角枫急性中毒小鼠，发现中毒小鼠的肝细胞水样变性，病变部位以肝小叶为主，伴汇管区淤血和静脉扩张，说明肝脏是八角枫毒性作用的主要靶器官之一。八角枫的根皮、须根中含有水杨苷类、生物碱等物质，须根含量较高，具备较好的抗炎止痛作用，具备一定的开发前景和应用价值，在疼痛类疾病(如风湿)的治疗中显效明显，目前以民间自用较多。临床上也曾用作肌松剂，但是由于八角枫的生物碱所含有的毒性，剂量不易控制，毒性较大，故逐渐被取代。临床工作中偶可见到因自行服用八角枫后出现麻痹的患者，还有服用八角枫导致死亡的案例[15-16]，这些都极大地限制了八角枫的临床应用。

代谢组学是一种新的技术方法[17-18]，旨在研究生物系统(组织、器官、细胞模型或整个有机体)全部代谢物组成的功能和代谢，通过观察生物系统受干扰或者刺激后的小分子代谢产物的改变来预测生物体系代谢途径的改变。代谢组学非常适合中医药多系统、多靶点特点的整体研究特点，通过借助现代化的科技和手段，动态化监测中草药给药后内源性代谢产物的变化，以快速评价中药毒性并分析其作用机制，寻找中药肝损伤的早期生物标志物、探讨中药的肝毒性机制。

质谱广泛应用于代谢组学研究，最常用的是液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法。气相色谱-质谱(GC-MS)用于样品制备技术成熟，通过评估保留时间/索引和电子碰撞质谱来识别代谢物能力强，这些优点使其广泛适用于代谢组学研究[19-20]。我们使用GC-MS技术结合多变量统计学分析方法研究了八角枫诱导的小鼠的代谢轮廓，分离效果较为满意。经八角枫诱导的大鼠与对照组比较，许多代谢物的血浆水平发生了明显变化，共筛选出12个内源性生物标志物。研究结果提示，在大鼠体内已经发生了糖、脂肪和蛋白质的代谢异常。不饱和脂肪酸能够起到抗脂质过氧化作用，减少脂质过氧化对细胞的损伤，保护肝细胞的正常工作，一系列不饱和脂肪酸含量下降表明肝脏对炎症的应激反应受到较大影响。糖类物质作为最基本的供能物质，戊糖和葡萄糖醛酸相互转化过程被干扰导致能量供应产生障碍。氨酰-tRNA途径影响蛋白质的合成，从而影响肝脏组织的稳定分泌、酶合成、解毒等重要功能。这表明八角枫能够在一定程度上诱导肝代谢紊乱，其机制可能是八角枫影响肝脏的脂质代谢、氧化应激、氨基酸代谢有关。本研究将基于GC-MS和多变量统计学技术的代谢组学方法成功应用于八角枫对大鼠肝代谢的研究。