多花黄精不同龄须根药材质量研究

陈怡 姚云生 陈松树 刘红昌 赵致

摘要：为了进一步了解多花黄精须根的价值，扩展多花黄精药用部位，缓解市场供需矛盾，充分利用资源。本文按照2015版《中国药典》（一部和四部）测定多花黄精不同龄须根水分、浸出物、灰分和多糖含量，利用比色法测定黄酮含量。结果表明：（1）多花黄精须根的水分含量为524%～553%，灰分含量为733%～867%，醇溶出物含量为4088%～4930%，水溶出物含量为3476%～3604%，多糖含量为574%～783%，黄酮含量为017%～028%;（2）多花黄精一年龄和二年龄须根多糖含量符合药典标准。所以，以多糖为主要药效成分时，适当调整处方量，多花黄精须根可以部分替代块茎使用。研究表明多花黄精须根具有一定的潜在药用价值，值得进一步开发研究。

关键词：多花黄精;须根;质量

中图分类号：S56723

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2019）06-0061-03国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.011

Study on the Quality of Radix in Different Ages of Polygonatum cyrtonema Hua

CHEN Yi1，YAO Yun-sheng1， CHEN Song-shu1，LIU Hong-chang1，2，ZHAO Zhi1，2*

（1.College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025，China; 2.Laboratory about Breeding and Planting of Traditional Chinese Medicine in Guizhou， Guiyang， Guizhou 550025，China）

Abstract：In order to further understand the value of Polygonatum cyrtonema Hua，and extend their medicinal parts to alleviate the contradiction between supply and demand in the market and make full use of resourcesIn this paper， the water content， extract， ash and polysaccharide content of P cyrtonema Hua were determined according to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （Part 1 and 4） The flavonoid content was determined by colorimetryResults：（1）the water content of fibrous root of P cyrtonema Hua was 524%～553%， ash content was 733%～867%， alcohol content was 4088%～4930%， water content was 3476%～3604%， polysaccharide content was 574%～783%， flavonoids content was 017%～028%;（2）Annual roots and biennial roots of P cyrtonema Hua meet the pharmacopoeia standards Therefore， when polysaccharides are the main medicinal ingredient， the amount of prescription is appropriately adjusted， and the yellow roots can partially replace the tuberIn conclusion，Polygonatum cyrtonema Hua has a certain potential medicinal value and deserves further research

Key words：Polygonatum cyrtonema Hua; root; quality

多花黃精P cyrtonema Hua是中药材黄精P Rhizoma的基源植物之一，用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴[1]。多花黄精主产于贵州、湖南、云南、浙江、安徽等地区[2]。多花黄精的块茎一般每年向前伸长一节，当年新生1节块茎，称一年龄块茎，该块茎上的须根称一年龄须根，与其相连接的1节块茎，称二年龄块茎，该块茎上的须根称二年龄须根，依此类推。

近年来，黄精药用价值和营养保健等价值不断被挖掘，而其药用价值主要集中在多糖和黄酮含量上。据“中药材天地网”调查，目前年需求量在3500～4000 t，2015年版《中国药典》规定的滇黄精Polygonatum kingianum、黄精Psibiricum和多花黄精Pcyrtonema 3种基原植物蕴藏量正急剧下降[3]。目前，传统经验认为多花黄精炮制前处理需剪去块茎上须根[4]，为了进一步了解多花黄精须根的价值，扩展多花黄精药用部位，缓解市场供需矛盾，充分利用资源，本研究对多花黄精须根进行质量考察，为须根的合理利用提供理论依据。

1材料与方法

11供试材料

供试材料于2018年10月采自贵州大禹王农业发展有限公司黄精种植基地，种植年限为五年，经贵州大学生命科学院赵财副教授鉴定为多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua。洗净材料，将须根按不同年龄分开（4年龄和5年龄块茎上须根已脱落），再用去离子水清洗，晾干表面水分后，称重，然于置于105℃条件下杀青30 min，60℃烘至恒重，称重，粉碎，过五号筛，备用。

本研究以三穗鸭为试验材料，检测ITPR1基因的遗传变异，分析其与蛋壳品质的相关性，探讨其对蛋壳性状的效应机制及其在蛋壳品质改良上的应用价值，为开展分子标记育种加快提高蛋壳质量提供参考，并为深入研究IP3R3基因的生物学功能奠定基础，提高鸭蛋品质。

1材料与方法

11试验动物及样品采集

随机选择饲养于贵州大学家禽研究所的同日出雏、健康无病、相同饲养管理条件下的三穗鸭母鸭144只，对90日龄鸭翅静脉采血02～05 mL。采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒（DP304）（天根生化科技北京有限公司）提取基因组DNA，12%琼脂糖凝胶电泳和NANODROP2000 DNA浓度测定仪（美国Thermo Scientific公司）联合评估提取质量，稀释成100 ng/μL进行保存备用，并收集45周龄的鸭蛋。

12鸭蛋壳品质的测定

将收集的鸭蛋使用分析天平测定蛋重和蛋壳重量，采用蛋壳厚度测定仪 （Egg Shell Thickness Gauge，Orka Technology Ltd） 测定蛋壳厚度，蛋壳强度分析仪 （Egg Force Reader，Orka Technology Ltd） 测定蛋壳强度;蛋形指数的测定用游标卡尺测量蛋壳的纵径和横径，计算蛋的纵横之比，并记录相关数据。

13引物设计和目的片段的扩增

根据GenBank数据库中CALM1基因mRNA（登录号：XM_0274578581）的序列信息，利用Primer 3 在线软件（http：//primer3utee/）和 UCSC（https：//genomeucscedu/） 对该基因的全部外显子和部分内含子设计引物，引物信息见表1。扩增总体积为20 μL的PCR反应体系：1 μL基因组 DNA模板，10 μL 2xEs Taq Master Mix，7 μL ddH2O，10 pmol/μL的上游引物和下游引物各1 μL。反应程序为95 ℃预变性8 min;95 ℃变性50 s，退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环;72 ℃终延伸6 min。

14筛选鉴定多态位点

对144只三穗鸭CALM1基因的每个扩增片段进行纯化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司直接测序，采用DNAMAN和Chromas软件进行SNPs筛查和鉴定。

15数据统计和生物信息学分析

使用Excel 2016，统计CALM1各个位点的基因型频率、等位基因频率、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC）和Hardy￣Weinberg平衡定律适合性检验。用SPSS 180 软件程序中一般线性模型完成三穗鸭CALM1基因SNPs位点基因型与蛋壳表型数据的关联分析，所有数据以“平均值±标准误”表示。

2结果与分析

21SNPs位点的筛选

通过在线软件设计的6对特异性引物，对三穗鸭CALM1基因进行PCR扩增，并采用DNA直接测序法测序，测序结果表明，一共发现3个突变SNPs位点（图1），分别位于第2内含子g21554634A>G、第3内含子g21554954T>C突变和第4内含子g21558072A>T。

22SNPs位点的群体遗传信息分析

通过对144只三穗鸭群体遗传信息分析，结果表明：g21554634A>G位点的优势基因型为AA，频率为0451，优势等位基因为A，频率为0670，杂合度为1793，多态信息含量为0334，属于中度多态（050>P>025）（表2）;g21554954T>C位点的优势基因型为TT，频率为0590，优势等位基因为T，频率为0778，杂合多为1528，多态信息含量为0286，属于中度多态（050>P>025）;g21554954T>C优势基因型为AA，频率为0542，优势等位基因为A，频率为0708，杂合度为1704，多态信息为0328，属于中度多态（050>P>025）。卡方（2）检验结果显示，各位点基因型分布未偏离Hardy￣Weinberg平衡（P>005）。

23SNPs位点各基因型与蛋壳品质的关联性分析

三穗鸭CALM1基因的SNPs位點各基因型与蛋壳品质的相关性分析结果见表3。从表可知：g21554634A>G位点的AG、GG基因型个体与AA基因型个体蛋壳厚度呈显著差异（P<005），AA型基因个体与AG、GG型基因个体的蛋壳强度差异

极显著（P<001），AA、AG基因型与GG基因型个

体蛋重呈显著差异（P<005）;g21554954T>C位点的CC基因型个体与TT、TC基因型个体蛋壳厚度呈显著差异（P<005），TT型基因个体与TC、CC型基因个体的蛋壳强度差异极显著（P<001），TT、TC基因型与CC基因型个体蛋重呈显著差异（P<005）;g21558072A>T位点的AT、TT基因型个体与AA基因型个体蛋壳厚度呈显著差异（P<005），AA型基因个体与AT、TT型基因个体的蛋壳强度差异极显著（P<001），AA、AT基因型与TT基因型个体蛋重呈显著差异（P<005）;其他蛋壳品之间无显著关联。

3结论与讨论

CALM1作为一种遗传因子，在动物体内起着重要的作用，与CALM2和CALM3共同编码CaM，这是一种普遍存在的、高度保守的Ca2+结合蛋白[13]。本研究以三穗鸭为材料，通过对CALM1基因检测，共检测到3个SNPs位点，分别位于第2内含子g21554634A>G、第3内含子g21554954T>C