冻融卵裂期胚胎与囊胚移植后单孕囊妊娠患者母婴结局的比较*

田莉峰，伍琼芳，夏雷震，王 娜，李小山

(1.江西省妇幼保健院辅助生殖中心，南昌 330006;2.吉安市妇幼保健院(儿童医院)，吉安 343000;3.江西师范大学心理学院，南昌 330022)

随着辅助生殖技术的发展，囊胚培养技术应用越来越广泛。与卵裂期胚胎移植相比，囊胚培养越过了胚胎基因组激活阶段，可挑选更有发育潜能的胚胎，单囊胚移植不仅保障了临床妊娠率和活产率，还明显降低了多胎妊娠率及多胎妊娠并发症的发生率[1]。囊胚培养延长了胚胎在体外的时间，且近年来越来越多的研究报道了囊胚移植的产科并发症，如早产[2-3]、先天畸形[4]、男/女性别比例增加[5]等。对于移植冻融卵裂期胚胎或囊胚，各研究结果不同[6]。因此，对卵裂期胚胎移植及囊胚移植的临床结局进行分析，可为临床医生及患者选择合适的移植策略提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015-01至2018-06在江西省妇幼保健院辅助生殖中心接受辅助生殖技术助孕治疗的患者，共2176个周期。纳入标准：冻融胚胎移植患者；移植后1个月B超见宫内单孕囊单胚芽妊娠者。排除标准：供精IVF周期来源的胚胎；PGT周期来源胚胎。患者均签署知情同意书，研究遵循《赫尔辛基宣言》。

1.2 冻融胚胎移植方案 自然周期：患者月经周期第10～12d开始监测卵泡发育，自排卵日开始黄体支持，黄体酮针剂40mg/d，根据患者冷冻胚胎的日龄，排卵后第3～5d行冻融胚胎移植，复苏1～2枚D3或D5/D6胚胎，在腹部B超引导下进行移植。移植后改用雪诺酮90mg/d放阴道。移植后12d抽血判断是否生化妊娠，移植后30d经阴道B超检查确定临床妊娠后，继续雪诺酮90mg/d+地屈孕酮片20mg/d至孕10周。人工替代周期：月经第2～3d给予补佳乐(戊酸雌二醇片，1mg/片，拜耳医药保健有限公司广州分公司)4～8mg/d，至内膜≥0.7cm时，给予黄体酮针剂80mg/d。根据患者冷冻胚胎的日龄，黄体转化后4～6d行冻胚移植，移植后改用雪诺酮90mg/d放阴道和口服地屈孕酮20mg/d。移植后12d抽血确定生化妊娠，移植后30d经阴道B超确定临床妊娠后，继续雪诺酮+地屈孕酮片黄体支持至孕10周。降调节人工替代周期：在患者月经来潮第2～3d肌肉注射促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)(贝依，3.75mg/支，上海丽珠公司)3.75mg，28～30d后开始给予补佳乐，其余流程同人工替代周期。

1.3 胚胎培养及评级 使用Vitrolife序贯培养试剂(G1系列)进行胚胎培养。取卵后48h和72h即第2d和第3d上午各评估胚胎1次。根据卵裂球大小均匀与否及无核碎片量进行胚胎质量评级，将胚胎分为4级。Ⅰ级：胚胎卵裂球连接良好、均匀、规则、有中等折光性，透明带完整，碎片≤5%；Ⅱ级：卵裂球形态规则或轻度不规则，均匀或稍欠均匀，折光度有轻微变化，碎片≤20%；Ⅲ级：胚胎内碎片少于50%，碎片外卵裂球形态同Ⅱ级，具有一定折光性，透明带完整；Ⅳ级：胚胎内碎片≥50%，碎片外卵裂球具有生存活力。根据这个评级标准，将D2为3～5细胞数、D3为7～9细胞数的Ⅰ、Ⅱ级胚胎评为优质胚胎(D2至D3只发育了2个卵裂球的胚胎除外)。胚胎第1d下午观察有对称的2细胞分裂，为胚胎早期卵裂。选择D2-3天优质卵裂期胚胎进行玻璃化冷冻保存。

囊胚培养：D3胚胎转入囊胚培养液G2(瑞典vitrolife公司)行囊胚培养至D5/D6，囊胚评级标准选用Gardner的标准[7]。根据囊胚的扩张和孵化程度将囊胚分为1～6期；对于3～6期囊胚，还需对内细胞团和滋养层细胞进行评分。1期：早期囊胚，囊胚腔体积<囊胚总体积的一半；2期：囊胚腔体积>囊胚总体积的一半；3期：完全扩张囊胚，囊胚腔占据整个囊胚；4期：扩张后囊胚，囊胚腔体积较早期囊胚体积明显扩大，透明带变薄；5期：正在孵化的囊胚，囊胚正从透明带破裂口孵出；6期：孵化出的囊胚，囊胚完全从透明带中孵出。

内细胞团(inner cell mass,ICM)评分：A级，细胞数多，结合紧密；B级，细胞数目少，结合较散；C级，细胞数极少。

滋养外胚层细胞(trophetoderm cell,TE)评分：A级，细胞数多，囊胚四周均有细胞分布；B级，细胞数较少，上皮细胞较松散；C级，细胞数极少。

选择受精后第5d选择3期以上囊胚进行玻璃化冷冻，如无3期以上囊胚，培养至第6d，如无4期以上囊胚，放弃冷冻。将D5～6囊胚分期≥3期，且其内细胞团(ICM)为A或B级定为优质囊胚。

1.4 观察指标 收集患者的一般资料，年龄、不孕原因、不孕年限及治疗情况。记录移植胚胎数及胚胎日龄，移植胚胎后12d抽血查β-HCG，移植30d阴道B超检测，B超检查见孕囊者，则定义为临床妊娠。妊娠12周以内的妊娠失败定义为早期流产。通过电话定期跟踪指导直至妊娠结束，记录妊娠的经过、分娩时间、分娩方式和并发症，新生儿的性别、出生体重及畸形情况。

2 结 果

2.1 冻融周期患者的一般资料比较 冻融卵裂期胚胎移植组与囊胚移植组患者的年龄、抗缪勒管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)、窦卵泡计数(antral follicle counting,AFC)、不孕年限、继发不孕症占比、排卵障碍占比、单胚移植占比，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组患者的BMI，以及管性因素、男性因素及子宫内膜异位症不孕症比例均无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 冻融卵裂期胚胎与囊胚移植患者的一般资料比较

2.2 冻融周期孕期流产情况及母亲孕期并发症比较 冻融囊胚移植组患者的流产率较卵裂期胚胎移植组略高，但差异无统计学意义(P>0.05)。两组的孕期并发症发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 冻融卵裂期胚胎与囊胚移植孕期流产情况及母亲并发症比较

2.3 冻融周期新生儿出生结局比较 冻融囊胚组患者的分娩孕周较卵裂期组更短，新生儿男女性别比例更高(1.42∶1 vs 1.09∶1)，差异有统计学意义(P<0.05)。两组新生儿出生体重、出生缺陷比较，差异无统计学意义(P>0.05)。囊胚组新生儿心脏畸形(0.76% vs 0.20%)、神经管畸形(0.25% vs 0.10%)、消化系统畸形(0.25% vs 0%)略高于卵裂期组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 冻融卵裂期胚胎与囊胚移植新生儿出生结局比较

2.4 两组出生性别比、出生体重、孕周多元回归分析 为避免混杂因素对出生结局的影响，使用多元logistic逐步回归及多元线性回归的方法来调整所有潜在的混杂因素，筛选出差异有统计学意义的指标列入表4中。关于出生性别比，纳入变量包含胚胎日龄、年龄、不孕年限、不孕类型、排卵障碍、移胚数，经过多元logistic回归分析后，发现胚胎日龄对出生性别比有影响(P<0.05)。关于出生体重，纳入变量包含胚胎日龄、年龄、不孕年限、不孕类型、排卵障碍、移胚数、出生性别，通过多元线性逐步回归分析后，发现出生性别影响新生儿出生体重(P<0.05)。关于孕周，纳入变量包含胚胎日龄、年龄、BMI、不孕年限、不孕类型、排卵障碍、瘢痕子宫、移胚数、出生性别，通过多元线性逐步回归分析后，发现胚胎日龄、继发不孕、瘢痕子宫及BMI均对孕周有影响(P<0.05)。见表4。

表4 出生性别比、出生体重、孕周多元逐步线性/logistic回归

3 讨 论

胚胎在体外培养时长是否影响辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)母婴安全及子代健康?对于单胎妊娠者移植囊胚的早产率是否高于卵裂期胚胎患者，国内外各研究结果不同。Dar等[3]和Martins等[8]研究发现，囊胚移植显著增加单胎早产率和围产儿死亡率。Feranando等[9]和De Vos等[10]研究发现，卵裂期胚胎和囊胚组的分娩孕周和出生体重无差异。2017年Wang等[11]meta分析结果显示，在新鲜胚胎移植周期中，移植囊胚的早产和极早产风险较卵裂期胚胎增加，而在冻融胚胎周期中无差异。上述研究中关于移植囊胚是否增加早产的结论不同，这可能与研究样本量不同及未区分新鲜还是冻融周期有关。本研究发现，冻融囊胚组的新生儿出生孕周小于冻融卵裂期组[(38.35±1.91)周 vs (38.65±1.73)周]，但差异无统计学意义(P>0.05)。经多元回归分析调整混杂因素后发现，胚胎日龄、继发不孕、瘢痕子宫及BMI均对孕周有影响(P<0.05)。囊胚移植可能增加早产的风险，但差异尚无统计学意义，这可能与样本量有关。本研究为避免双胎导致的早产对出生结局的影响，选择超声检查后为单孕囊单胚芽妊娠的患者，减少了多胎对早产的影响。未来需更大样本量及多中心的研究结果来进一步验证。

2018年Holden等[12]发现，冻融囊胚较卵裂期胚胎移植改善了妊娠结局，且两组的新生儿出生结局相似。2019年Zhang等[13]对冻融卵裂期胚胎及囊胚移植后4201个单胎分娩的新生儿出生体重进行了分析，发现组间平均出生体重比较无差异，但是囊胚组大于胎龄儿(large for gestational age,LGA)出生比例、出生性别比及年龄别体重Z评分(用于评估新生儿生长发育情况)均高于卵裂期胚胎组。经多元回归分析发现，出生体重和移胚数呈正相关。冻融囊胚移植增加新生儿出生体重，这与新生儿性别及Z评分相关。本研究中囊胚组新生儿出生体重较卵裂期胚胎组高(3409.9±516.2 vs 3364.6±502.2)，但差异无统计学意义(P>0.05)。经多元回归分析后发现，出生性别影响出生体重(P<0.05)。囊胚组男女出生性别比高于卵裂期胚胎组，这可能影响了新生儿的出生体重。

关于新生儿出生缺陷及母亲孕期并发症，各研究结果不同。有研究发现[14-16]，与卵裂期胚胎相比，囊胚组的围产期死亡率和妊娠期并发症的风险更高。但有研究[9,17-18]指出，囊胚与卵裂期胚胎移植后的母亲孕期并发症和新生儿出生结局相似。Shi等[19]研究显示，两组的出生缺陷、早产、低及极低出生体重方面无差异，但囊胚组男/女性别比增高。Hargreave等[20]在2019年JAMA上发表了一项对丹麦长达16年的1085172例大样本的冻融胚胎出生子代健康研究显示，FET出生儿童的癌症患病风险高于正常妊娠出生儿童。其他类型的辅助生殖技术，如IVF(HR0.96，95%CI0.70～1.32)和ICSI(HR1.33，95%CI0.94～1.89)与儿童癌症之间没有任何显著的关系，只有FET才有。不同的不孕症治疗方式，包括使用助孕药物(如克罗米芬、促性腺激素、促性腺激素释放激素类似物、人绒毛膜促性腺激素、孕酮及雌激素)与儿童癌症之间也没有明显的关系。冷冻胚胎移植的相关效应也不局限于儿童癌症，与新鲜胚胎移植后出生的儿童相比，冻融胚胎出生的儿童有更高的平均出生体重及大孕周风险。Hargreave等[20]研究显示，冷冻保存技术可能导致胚胎发育过程中出现变化，从而影响胎儿宫内生长。胎儿过度生长与儿童癌症风险增加有关，可能是表观遗传学改变所致。本研究中囊胚组出生缺陷及孕期并发症与卵裂期胚胎组相比均无差异。未来还需对辅助生殖技术助孕的母儿进行更大样本及更长期的随访，以了解母亲及子代的远期风险是否高于正常人群。

本研究还发现，囊胚组的男/女性别比显著高于卵裂期胚胎组(1.42 vs 1.09,P<0.05)；经多元回归分析发现，移植胚胎的日龄影响出生性别(P<0.05)。研究表明，在自然妊娠中影响出生性别的因素包括父母年龄[21]、生活方式[22]以及接触二噁英[23]等。而在ART过程中，影响出生性别的因素主要包括受精方式(IVF或ICSI)[24]、胚胎日龄等[25-26]。早前关于鼠类和猪的研究表明[27-28]，与雄性胚胎相比，雌性胚胎分裂和发育速度更慢。而在人类，关于植入前胚胎的研究表明，雄性胚胎的发育速度明显高于雌性[29]，从受精后第2日开始，雄性胚胎发育速度较雌性至少提前4.5h[30]。Bouillon等[31]移植了第5日扩张率最高的胚胎，发现此类胚胎子代男性比例显著增加。细胞数越多、分裂速度越快的胚胎，男性的概率越大，因此，男性胚胎被选为优质囊胚进行移植的概率也越大[24,32]。此外，调控抗氧化、葡萄糖摄取和新陈代谢的基因位于X染色体，而这些基因或其调控的某些酶活性可能影响雌性胚胎的发育速度[24]。据联合国相关研究，传统自然妊娠出生婴儿男/女比值在1.02～1.07之间。随着ART技术的发展，胚胎培养技术的成熟，囊胚培养在ART中的应用越来越广泛。Chang[5]及丁锦丽等[33]的meta分析，比较了不同时间及不同地域，囊胚与卵裂期胚胎移植后子代男/女比值，结果表明囊胚移植后男/女比值显著高于卵裂期胚胎(OR=1.29，95%CI=1.10～1.51)(OR=1.12，95%CI=1.07～1.16)，且不受时间和地域的影响。

综上所述，与移植卵裂期胚胎相比，囊胚不增加新生儿出生缺陷及孕期并发症风险，但可能增加子代男性出生比例。未来需要更多、更详细的围产期数据、更大样本量及更长远的产后随访研究，以帮助研究卵裂期与囊胚移植后单胎妊娠短期的婴儿期和长期的儿童发育的差异，及人口性别比例改变可能带来的社会影响，从而为临床治疗提供更多有力的证据。囊胚移植可提高种植率，但如何平衡妊娠率、多胎率、卵巢过度刺激、母婴并发症及子代健康等潜在风险?未来的研究可专注于：(1)优化挑选胚胎的方法以提高妊娠率；(2)优化胚胎培养系统，允许体外长期、安全地培养人类胚胎；(3)研发出预测妊娠率高的胚胎的生物标记物。总之，在今后的临床移植策略制定过程中，需考虑囊胚移植的这些可能的影响。