sICAM-1和IL-36在儿童支原体肺炎中的临床研究

李 丹，高淑青，曲艳杰，王冬梅

(1.包头医学院，内蒙古包头 014060;2.包头市第四医院)

肺炎支原体感染是社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)最常见的原因之一，占10.0 %～40.0 %[1]。肺炎支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是儿童常见的呼吸系统疾病。一项研究表明，5岁以上儿童肺炎支原体肺炎约占CAP的70.0 %。我国北方地区肺炎患儿MPP检出率达37.5 %[2]。MPP患儿可出现胸腔积液、多器官损害或严重的长期后遗症。由于目前还没有可靠和快速的诊断试验来检测肺炎支原体，治疗在大多数情况下是经验性的。目前的实验室诊断指标，包括上呼吸道咽拭子标本的聚合酶链反应(PCR)和血清学，并不能区分肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)感染和携带者[3]，有研究表明携带MP的健康儿童可高达56.0 %[4]，因此能够早期快速确认MP感染者在临床工作中至关重要。目前大多数中心仍采用恢复期和急性期IgG水平增加≥4倍来确认MP感染，但敏感性低[5]。近年来有研究表明IL-36和sICAM-1与肺炎支原体肺炎相关[6-7]。本研究探讨可溶性细胞间粘附分子-1(soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)和白介素(interleukin-36，IL-36)在MPP表达水平及临床意义。

1 对象与方法

1.1对象 选取2019年3月至2020年1月于内蒙古包头市第四医院儿科住院治疗并确诊肺炎的66例患儿为研究对象，选取同期支气管异物患儿16例为正常对照组。MPP组28例，男12例,女16例,年龄(5.51±1.70)岁；非MPP组38例,男20例,女18例,年龄(4.60±2.28)岁；对照组16例,男8例,女8例,年龄(4.43±1.84)岁。3个组患儿年龄,性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有入选患儿均符合第八版《诸福堂实用儿科学》社区获得性肺炎(CAP)及MPP的诊断标准[8]。CAP的诊断要点：指医院外，即社区内获得的病原体引起的儿童肺实质急性感染，临床症状主要表现为发热、咳嗽、胸痛、缺氧等感染症状。MPP的诊断标准：(1)发热、持续剧烈咳嗽和其他呼吸道感染等临床症状，肺炎，甚至胸腔积液等影像学改变，X线所见远较体征显著；(2)白细胞数大多正常或稍增高，重症患儿可有白细胞降低，肺炎支原体分离培养是金标准；(3)青霉素、头孢类抗生素无效；(4)单次MP-IgM抗体≥1:160或恢复期和急性期双份血清MP-IgG抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时，可诊断MP感染；(5)MP核酸检测阳性。纳入标准：(1)符合第八版《诸福棠实用儿科学》肺炎及MPP的诊断标准；(2)年龄≤14周岁；(3)病程≤15 d；(4)所有患儿均经家属知情同意。排除标准：(1)病原诊断不明确；(2)患有肺结核、支气管哮喘、过敏性鼻炎等其他呼吸系统疾病；(3)呼吸系统发育不良及畸形；(4)既往患有免疫性疾病以及近期或长期服用糖皮激素史；(5)近2个月内应用免疫球蛋白、干扰素等免疫制剂等患儿。本研究经包头市第四医院伦理委员会批准,所有研究对象监护人均知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集 于入院第1 d或次日清晨采集患儿咽拭子标本进行患儿呼吸道病原基因检测，同时采集患儿外周静脉血进行病原检测(MP-IgM、MP-IgM等)。于入院后7～10 d内患儿病情稳定时行支气管镜介入治疗取肺泡灌洗液标本，正常对照组于就诊当天收集肺泡灌洗液标本，均保存于无酶无菌的EP管中置于-80 ℃冰箱保存待测。MP及相关病原检测均由包头市第四医院检验科提供检测。

1.2.2肺泡灌洗液中IL-36、sICAM-1的检测 采用ELISA法检测所有研究对象肺泡灌洗液中sICAM-1和IL-36的水平，试剂盒由上海江莱生物有限公司提供。IL-36的检测：(1)标本于室温下，离心20 min左右(2 000～3 000 r/min)，分离上清液，保存于-20 ℃冰箱保存备用；(2)提前20 min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温；(3)从冰箱中取出浓缩洗涤液放置室温，轻摇均匀，结晶完全溶解后配置洗涤液，将20 mL浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400 mL工作浓度的洗涤液，未用完的放回4 ℃的冰箱保存；(4)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度(将IL-36标准品稀释浓度依次为：400、200、100、50、25、12.5 pg/mL)的标准品50 μL，样本孔中加入待测样本50 μL；空白孔不加；(5)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱温育60 min；(6)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350 μL)，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；(7)每孔加入显色剂A、B各50 μL，轻轻震荡均匀37 ℃避光孵育15 min；(8)每孔加入终止液50 μL，由蓝色转为黄色，15 min内在450 nm波长处测定各孔的OD值。sICAM-1的检测方法同IL-36。

2 结果

2.13组患儿肺泡灌洗液中sICAM-1及IL-36水平比较 3组患儿间肺泡灌洗液中sICAM-1表达水平比较及差异有统计学意义(F=30.359,P=0.000),IL-36相对表达水平比较差异有统计学意义(F=70.849,P=0.000)。见表1。

表1 3组患儿sICAM-1和IL-36水平比较

2.2肺泡灌洗液IL-36、sICAM-1对诊断MPP的分析 sICAM-1诊断肺炎支原体肺炎的AUC为0.818(95 %可信区间为0.703-0.902)，最佳临界点为305.95 ng/mL，其敏感度为71.43 %，特异度为84.21 %。；IL-36对诊断MPP的AUC为0.875(95 %可信区间为0.770-0.944)，最佳临界点为22.435 pg/mL，其敏感度为75.00 %，特异度为89.47 %。

图1 IL-36、sICAM-1诊断MPP的ROC曲线图

3 讨论

有研究指出MPP的发病在5岁以上儿童中最为普遍[9]，其并发症严重威胁患儿的生命健康，在临床上能够快速检测且准确的实验室指标对于诊治MPP至关重要。sICAM-1属于免疫球蛋白基因家族，是一种粘附分子，可介导炎症细胞的聚集和转移，促进炎症细胞的募集和局部病变炎症反应的激活[10]，主要在I型肺泡上皮细胞(Type I alveolar epithelium cell,AECs-I)中表达，可促进细胞之间的相互作用，增强慢性炎症反应，具有调节炎性细胞与内皮细胞之间黏附的作用。当气道上皮细胞受到病原体刺激时,sICAM-1与β2整合素、淋巴细胞相关抗原-1(lymphocyte functional antigen-1,LFA-1)/巨噬细胞分化抗原-1(macrophage antigen-1,Mac-1)结合，参与炎症细胞信号传导及活化，使炎症细胞向肺部的募集并粘附于内皮细胞导致炎性因子释放及炎性渗出,使气道发生炎症反应[11]。杜莉等[12]研究发现sICAM-1在支原体肺炎患儿中升高，可作为临床诊断、评估和治疗支原体肺炎的有效指标。IL-36是一种炎症细胞因子，是IL-1家族的新成员。IL-36由IL-36α、IL-36β和IL-36γ三种激动剂和IL-36受体拮抗剂(IL-36Ra)组成[13]。IL-36在支气管上皮细胞、巨噬细胞、CD4+T等细胞中均有表达[14]。IL-36激动剂与受体辅助蛋白(Interleukin-1 Receptor Accessory Protein，IL-1RAcP)结合，然后激活髓样细胞分化蛋白88(myeloid differentiation protein，MyD88)、核转录因子NF-κB(nuclear factor-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)炎症信号通路，促进炎症反应[15]。潘莉等[16]研究发现IL-36在急性期MPP患儿中明显增高，表明IL-36对MPP诊断具有一定临床价值，也有研究提出IL-36是MPP的一个有用的预测因子或生物标志物[17]。

本研究结果显示，sICAM-1、IL-36在肺炎支原体肺炎中的表达水平高于非MPP组和健康对照组，非MPP组高于健康对照组，3个组患儿之间比较差异有统计学意义。从IL-36、sICAM-1对于诊断肺炎支原体肺炎的ROC曲线可见，两者对肺炎支原体肺炎具有较高的特异度及灵敏度。IL-36参与T细胞免疫反应，诱导T细胞发生极化,其IFN-γ可增强IL-36对T细胞的增殖效应。此外，IFN-γ还是一种多效性细胞因子，有研究表明sICAM-1和IFN-γ水平之间密切相关，IFN-γ可引发sICAM-1表达的增加[18]。可见sICAM-1和IL-36在MPP中存在着某种共同的作用机制，MPP的炎症反应中两指标可能存在相互作用，因此同时检测两指标对MPP的诊断更有意义，两者在MPP中的共同作用机制还有待进一步研究。

综上所述，sICAM-1和IL-36对肺炎支原体肺炎具有重要的临床价值，早期检测sICAM-1和IL-36在MPP中的表达水平有助于MPP患儿的临床诊断。