卵母细胞玻璃化冷冻的临床应用价值

孙贤 姜宏 刘迎春 倪丰 朱杰

1安徽医科大学解放军临床学院生殖医学中心（合肥230031）；2中国人民解放军联勤保障部队第901 医院生殖医学中心（合肥230031）

三十年前澳大利亚学者首次实现冻融卵母细胞妊娠和活产［1］，为冻融卵母细胞的临床应用提供了理论与实践基础。玻璃化冷冻技术较传统的程序化慢速冷冻技术具有简单、快捷、不需要昂贵的程序化冷冻仪等优点，并可显著提高冻融卵母细胞及胚胎的复苏率和发育潜能，改善其临床结局，已广泛应用于辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）领域［2-3］。由于卵母细胞自身的形态学特点，其冷冻复苏率及复苏后的发育潜能远低于精子及胚胎，但随着玻璃化冷冻技术的发展，卵母细胞的冷冻复苏率大幅提高，已从最初主要应用于女性患者放、化疗前的生育力保存，拓展到实施ART 过程中取卵日因各种原因无法获得可用精子的被动卵母细胞冷冻，以及因延迟生育进行女性生育能力保存的主动卵母细胞冷冻，成为ART 的重要组成部分［2，4］。

目前卵母细胞玻璃化冷冻技术虽已在全国各大中心相继开展，但其临床应用远不及精子及胚胎，笔者通过回顾性分析本中心卵母细胞玻璃化冷冻患者的临床结局，旨在探讨冻融卵母细胞单精子注射-胚胎移植（intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，ICSI-ET）的可行性、安全性及临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组回顾性分析2013年1月-2019年12月在安徽医科大学解放军临床学院生殖医学中心行冻融卵母细胞ICSI-ET 共113 个周期的临床资料，将其设为冻卵组，按1：3 比例随机抽取同期行新鲜周期ICSI-ET 共339 个周期作为对照组。纳入标准：（1）年龄＜40 岁，FSH＜10 mIU/mL，AMH＞1.1 ng/mL；（2）移植胚胎均为卵裂胚；（3）取卵周期数≤2 次。排除标准：（1）男、女任一方染色体异常；（2）盆腔结核；（3）严重子宫内膜异位症；（4）复发性流产；（5）宫腔粘连；（6）高泌乳素血症；（7）合并严重全身性疾病及内分泌疾病。

1.2 方法

1.2.1 控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS）方案包括拮抗剂、长方案、微刺激、高孕激素降调及黄体期促排卵方案，结合阴道B超和血清FSH、LH、E2、P 水平监测卵泡发育情况，适时调整促性腺激素（Gn）剂量，当2 个主导卵泡直径≥18 mm 或3 个≥17 mm 时，皮下注射人绒毛膜促性腺激素（hCG，艾泽，默克雪兰诺，意大利）250 μg，36 h 后B 超引导下经阴道穿刺取卵。

1.2.2 卵母细胞玻璃化冷冻采用日本加藤公司冷冻试剂盒对卵母细胞行玻璃化冷冻，冷冻方法参照操作说明适当调整。将成熟（MII）卵母细胞置入冷冻试剂1（ES）中6～8 min，期间观察卵胞浆在ES 中的形态变化，待卵胞浆完全恢复进行下一步。如10 min 形态仍未恢复可延长ES 作用时间，但不超过15 min，随即将卵母细胞移入冷冻试剂2（VS）中平衡1 min，装载入冷冻载杆，快速投入液氮。

1.2.3 卵母细胞解冻激素替代（hormone replace treatment，HRT）周期内膜转化日行卵母细胞复苏，按照操作说明进行。将卵母细胞依次置入解冻试剂1（TS）：1 min，解冻试剂2（DS）：3 min，解冻试剂3（WS1）：5 min，解冻试剂4（WS2）：5 min。之后转入G-IVFPLUS 中孵育2 h。

1.2.4 解冻卵母细胞的存活标准解冻后存活卵母细胞在镜下均匀透亮、透明带完整、质膜无破裂、胞质无变性固缩及外流、卵周间隙均匀存在且无明显增宽或消失、有立体折光；死亡卵母细胞外观暗淡无光、体积增大、质膜边界不清、胞质变性或固缩、无立体折光。

1.2.5 授精采用ICSI 方式对存活MII 卵母细胞授精，培养18 h 后观察卵母细胞受精情况，D3 进行卵裂胚观察和评分。可利用胚胎定义为D3 正常受精且5 个卵裂球Ⅲ级以上胚胎，优质胚胎定义为D3 正常受精且7 个卵裂球Ⅱ级以上胚胎。

1.2.6 子宫内膜准备冻卵组采用HRT 方案准备内膜，月经周期第2 ～3 天口服戊酸雌二醇（补佳乐）4 ～6 mg/d，当内膜厚度≥8 mm 时，肌肉注射黄体酮注射液40 mg/日或黄体酮凝胶1.25 mg/日（纳阴）转化内膜，转化内膜第4 天进行胚胎移植，并继续黄体支持。对照组于取卵后D3 进行胚胎移植，黄体支持方案同冻卵组。

1.2.7 胚胎移植及妊娠结局选择1 ～3 枚D3 可利用胚胎移植（其中移植3 枚胚胎者均在2017年之前且前一周期种植失败或年龄＞35 岁），移植后30 ～35 d 阴道超声见孕囊定义为临床妊娠，确诊为宫内妊娠后，随访并记录临床结局。

1.3 统计学方法采用SPSS 21.0软件包进行统计分析，结果以均数±标准差或百分率（%）表示，计量资料组间比较用t检验，计数资料组间比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵母细胞玻璃化冷冻原因分析本研究113个冻卵周期共冻存卵母细胞1 268 枚，冻卵原因包括取卵日男方无活精子（包括睾丸附睾穿刺未获得精子）、男方取精失败且拒绝睾丸附睾穿刺、取卵日家庭意外（亲属病亡、交通事故及家庭矛盾等）而行被动冷冻；女方获卵数较多（≥25 枚），对部分卵母细胞（6 ～20 枚）行主动冷冻，见表1。

表1 卵母细胞冷冻原因分析Tab.1 Analysis of the causes of oocyte vitrification

2.2 患者基本情况由表2 可见，两组间平均年龄、体质量指数（BMI）、不孕年限、基础FSH 差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两组患者基本资料Tab.2 Basic data of patients between the two groups±s

表2 两组患者基本资料Tab.2 Basic data of patients between the two groups±s

指标周期数（个）女方年龄（岁）BMI（kg/m2）不孕年限（年）基础FSH（mIU/mL）冻卵组113 29.56±4.32 22.59±3.67 4.16±2.59 7.34±2.12对照组339 29.99±4.40 23.00±3.53 4.54±3.27 7.40±1.80 t 值/-0.899-1.050-1.271-0.276 P 值/0.369 0.294 0.205 0.783

2.3 两组体外受精结果比较由表3 可见，1 268枚冷冻卵母细胞解冻后存活1 087 枚，复苏率为85.73%。冻卵组的卵裂率、D3 优质胚胎率显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），两组间受精率、D3 可移植胚胎率、移植优质胚胎率、移植胚胎数差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 两组体外受精结果比较Tab.3 Comparison of in vitro fertilization results between the two groups

2.4 临床及新生儿结局比较冻卵组113 个周期行ICSI 后有可移植胚胎周期92 个，无可移植胚胎周期21 个，周期取消率为18.58%（21/113）；对照组339 个周期行ICSI 后有可移植胚胎周期306 个（行新鲜胚胎移植222 个周期，因预防OHSS、孕酮＞1.5 ng/mL 等原因行全胚冷冻84 个周期），无可移植胚胎周期33 个，占9.73%（33/339），无可移植胚胎周期率显著低于冻卵组，差异有统计学意义（9.73%vs.18.58%，P＜0.05），两组间种植率、临床妊娠率、异位妊娠率、流产率、活产率、平均分娩孕周、平均新生儿出生体重及出生缺陷率差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 两组患者临床及新生儿结局比较Tab.4 Comparison of clinical and neonatal outcomes between the two groups±s，%

表4 两组患者临床及新生儿结局比较Tab.4 Comparison of clinical and neonatal outcomes between the two groups±s，%

注：*P ＜0.05

指标移植周期数（个）无可移植胚胎周期率（%）种植率（%）临床妊娠率（%）异位妊娠率（%）流产率（%）活产率（%）平均分娩孕周（images/BZ_18_2163_439_2190_484.png±s，周）平均新生儿出生体重（images/BZ_18_2163_439_2190_484.png±s，g）出生缺陷率（%）冻卵组92 18.58（21/113）25.12（51/203）43.48（40/92）0 22.50（9/40）33.70（31/92）38.31±2.36 3 217.35±626.05 0对照组222 9.73（33/339）27.53（128/465）47.30（105/222）0 15.24（16/105）40.09（89/222）38.31±2.27 3 093.16±578.63 0 t/χ2值/6.309 0.416 0.382/1.071 1.126-0.002 1.067/P值/0.012*0.519 0.537/0.301 0.289 0.998 0.288/

3 讨论

既往卵母细胞冷冻多用于卵巢功能不全、恶性肿瘤放化疗前、子宫内膜异位症及各种原因推迟生育女性的生育能力保存［5-8］。但在IVF-ET 周期中常遇到因取卵日男患者取精失败或未获得活精子，需实施卵母细胞紧急冷冻的情况［9-10］。本研究的结果显示，该原因占本中心卵母细胞冷冻的64.60%，是实施被动卵母细胞冷冻的主要原因。该情况下，采取紧急卵母细胞冷冻策略，不仅可减轻患者的心理及精神负担，还可节约治疗费用。2013年美国已有50%以上的生殖中心实施卵母细胞冷冻技术，其中因医疗因素占18%，并将其列为成熟的临床应用项目，在临床广泛应用［2，4］。

对于高龄女性生育群体、高龄失独、罹患肿瘤及卵巢功能不全女性，由于其卵巢储备功能下降及卵母细胞质量异常，常难以通过自身卵母细胞获得子代，冷冻卵母细胞捐赠是该类患者获得子代的有效途径。本研究共对36 例获卵数较多（≥25 枚）患者实施主动卵母细胞冷冻，占全部卵母细胞冷冻的31.86%。与精子相比卵母细胞更为稀缺和珍贵，且国内尚无卵子库，因此对IVF 过程中部分年轻且获卵数较多的患者冻存部分卵母细胞，不仅可为患者本人提供生育保险，同时可有效避免大量剩余胚胎的浪费，为有赠卵需求的不孕患者提供较高质量的卵源。

实现活产所需的冷冻卵母细胞数量是生殖医学工作者和患者共同关注的问题。有研究表明活产率随年龄的降低和冷冻卵母细胞数量的增加而增加［11］，每个冷冻卵母细胞的妊娠率为4.5% ～12%［12］，获得1 个活产需要至少10 枚卵母细胞［13］，因此国内外学者认为需生育力保存而行卵母细胞冷冻的女性年龄应≤35 岁、每次至少冷冻保存卵母细胞8 ～10 枚［4，14］。本研究对113 例不孕患者实施卵母细胞冷冻，每周期主动冷冻者冷冻6 ～20 枚，被动冷冻者冷冻所有卵母细胞（5 ～30 枚），根据患者冷冻卵母细胞数每周期解冻5 ～20 枚，平均10 ～12 枚，活产率为33.70%，与对照组间差异无统计学意义（40.09%，P＞0.05）。

卵母细胞由于体积较大，细胞内水分较多、膜的渗透性较低，冷冻保护剂和水分无法快速有效进出细胞；此外，卵母细胞具有独特的亚细胞结构，其染色体直接暴露于细胞质中无核膜的保护，在冷冻和复苏过程中产生的渗透压变化极易导致DNA 及微管损伤［15］。因此，与胚胎冷冻相比卵母细胞冷冻的复苏率更低，受精率及临床结局更差［3］。玻璃化冷冻技术可使细胞内和细胞外环境迅速固化成玻璃状态，不会形成冰晶导致细胞及核损伤，可获得较慢速冷冻更高的复苏率、受精率及胚胎种植率［16-17］；此外，采用ICSI 作为玻璃化冷冻卵母细胞的受精方法可以有效解决因冷冻导致的透明带硬化和受精障碍问题，极大改善了卵母细胞冻融的临床结局［2-3］。本研究采用玻璃化冷冻技术共冻存卵母细胞1 268 枚，冻融卵母细胞复苏存活率为85.73%，与近期的报道相近（84%）［9，18-19］。同时，本研究的结果显示，冻卵组的可移植胚胎率、种植率、妊娠率、活产率与对照组均无显著性差异，表明卵母细胞冻融并不影响其发育潜能，可获得与新鲜卵母细胞相近的临床结局［9，20-21］。有学者发现［22］，冷冻和复苏过程可导致卵母细胞DNA 断裂、纺锤体和细胞器损伤及卵子老化。本研究中冻卵组的卵裂率和优质胚胎率均显著低于对照组，无可移植胚胎周期率显著高于对照组，提示玻璃化冷冻和复苏过程仍可能对卵母细胞造成一定的损伤。

卵母细胞冻融及临床应用的安全性是不可忽视的问题。研究表明，玻璃化冷冻卵母细胞出生的1 027 名儿童与使用新鲜卵母细胞出生的1 224 名儿童相比，其产科结局（糖尿病、高血压、早产）、分娩时孕周、出生体重、出生缺陷率、Apgar 评分及围产期死亡率差异均无统计学意义［23］。进一步研究表明，冻融卵母细胞胚胎的非整倍体率与新鲜卵母细胞来源胚胎的非整倍体率相似［24］。本研究的结果显示，冻卵组的流产率、异位妊娠率及活产率与对照组间均无显著性差异；共31 例分娩患者中，平均分娩孕周、平均新生儿出生体重及出生缺陷率均与对照组间无显著性差异。但尚缺乏对冻融卵母细胞出生子代长期随访的数据，其远期安全性仍需进一步研究证实。

综上所述，笔者所在中心的研究结果表明，卵母细胞冷冻可获得与新鲜卵母细胞相近的临床结局，可作为取卵日各种原因导致取精失败的ART补救措施。同时对IVF 过程中部分年轻且获卵数较多的患者冻存部分卵母细胞，不仅可为患者本人提供生育保险，而且可为有赠卵需求的不孕患者提供较高质量的卵源。基于本研究样本量较少、且为回顾性分析，卵母细胞玻璃化冷冻技术的安全性、可行性及临床价值仍需大样本、多中心RCT 研究进一步证实。