摩腹手法对原发性失眠大鼠行为学状态的影响

高建辉，张超凡，崔小锋，余云飞，王 程

（新疆医科大学附属中医医院，乌鲁木齐 830001）

失眠现已成为社会普遍存在的、严重影响公众身心健康和生活质量的健康问题，长期失眠不仅会增加多种疾病的患病风险，同时还会影响焦虑、抑郁等情绪状态和精神疾病的发生[1]。近年来，越来越多的行为学测试被应用于动物实验中，通过观察动物焦虑、抑郁等行为学状态的变化，可对模型质量和干预疗效进行评价[2]。中医推拿疗法中的摩腹手法现已被应用于原发性失眠的临床治疗中，具有疗效确切、易于患者接受等优势。本研究通过观察摩腹手法对原发性失眠模型大鼠行为学状态以及脑内神经递质水平的影响，探讨摩腹手法调节大鼠焦虑和抑郁状态的机制，希望能为失眠的推拿治疗提供科学的实验依据。

1 实验材料

64 只SPF 级Wistar 大鼠，雌雄各半（新疆医科大学动物实验中心），体质量（250±50）g，在新疆医科大学实验动物中心SPF 级屏障系统环境下喂养，光照12 h，安静通风，温控18～22 ℃。适应性喂养3 d后，采用分层随机分组法分为：空白组、模型组、摩腹组和拮抗组各16 只，每组雌雄各半。5-HT 检测试剂盒（H104）、DA 检测试剂盒（H170）、NE 检测试剂盒（H096）、ACH 检测试剂盒（A105）（南京建成生物科技有限公司），戊巴比妥钠（上海信帆生物科技有限公司），食欲素受体拮抗剂MK-4305（MB3773，大连美仑生物技术有限公司）。

2 实验方法

2.1 实验造模 针对模型组、摩腹组和拮抗组的大鼠进行原发性失眠造模。采用自制改良平台水环境法：准备桶口直径约30 cm、高约40 cm 的塑料圆筒作为鼠箱，其内底部固定1 个直径约6 cm、高约10 cm 的圆柱体平台；桶内注水并使水面保持在平台面下方约1 cm 处，水温保持约20 ℃；将造模大鼠放于平台上，每桶1 只。准备直径约25 cm、网格边长约1 cm 的圆形铁丝网，用细铁丝横穿铁丝网面并使其两端扣住桶口，可将铁丝网水平固定在桶内，保持铁丝网高度在平台上方约15 cm；铁丝网上放置饮水和食物。每日更换桶内清水并进行清洁消毒，持续8 d。

模型评价：造模结束后，4 组大鼠均进行戊巴比妥钠协同睡眠试验[3]。根据预实验测出确保所有大鼠发生睡眠的最小阈剂量，给予大鼠戊巴比妥钠溶液腹腔注射，记录大鼠的睡眠潜伏时间和睡眠时间。翻正反射消失1 min 起判定开始睡眠，翻正反射恢复判定睡眠结束。统计分析4 组大鼠的睡眠潜伏时间和睡眠时间，P＜0.05 则判定造模成功。

2.2 干预方法 摩腹组：操作者左手将大鼠束缚，左手五指可将大鼠四肢固定伸展开，并使其保持仰卧位，右手进行摩腹手法操作：操作者右手中指末节指腹罗纹面着实于大鼠腹部关元，余四指自然平伸，通过肩关节在外前方向的小幅度环转，带动中指在大鼠腹部做逆时针方向环形平移摩擦；移动路线为鸠尾、关元和双侧带脉穴形成的闭合圆环；频率每分钟5～7 圈，持续5 min 后，以同样方法顺时针再操作5 min。手法要求平稳着实，每日1 次，连续14 d。拮抗组：食欲素受体拮抗剂（10 mg/kg）溶液每日灌胃[4]，2 h 后给予摩腹手法，操作同摩腹组。模型组和空白组：每日于固定架束缚10 min，每日1 次，持续14 d。

2.3 行为学实验 干预结束后4 组大鼠进行行为学测试。

2.3.1 旷场试验 旷场箱为底面边长100 cm、高40 cm的黑色立方形箱体，底面由灰线均分成25 个正方形小格，外层的16 个方格为外周区，中央的9 个方格为中央区。从大鼠被放入正中央的方格内时开始计时，通过配套图像采集设备和软件进行行为学数据收集，观察3 min 内大鼠在旷场箱内的运动总距离、站立次数及在中央区停留时间。每次测试结束后清理粪便，并用75%乙醇清洁箱底面和内侧壁后，再进行下一只测试。

2.3.2 高架十字迷宫试验 迷宫为通体呈深灰色的十字形结构，由两条开放臂和两条闭合臂（开、闭臂长45 cm、宽15 cm、高30 cm）以及一个连接它们的中央平台（边长15 cm）组成，迷宫距地面高度60 cm。试验开始前预先让大鼠头朝向一侧闭合臂，从其被放上中央平台时开始计时，记录5 min 内大鼠的行为学指标：开放臂进入次数（OE）、开放臂进入次数百分比（OE%）、开放臂停留时间（OT）、开放臂停留时间百分比（OT%）和中央平台停留时间（CT）。每次测试结束后清理粪便，并用75%乙醇擦拭迷宫内侧壁及底面。

2.4 取材及标本处理 4 组大鼠麻醉完全后依次断头取脑，分离出脑干组织，将其称取质量后匀浆、离心，取上清。

2.5 检测指标 运用酶联免疫吸附技术（ELISA）测定脑干样品内5-HT、NE、DA 和ACH 的水平，根据各自试剂盒的说明进行检测。记录各组样品的OD 值，运用配套软件绘制出标准品曲线，计算相应浓度水平。

2.6 统计学处理 运用SPSS 21.0 统计软件，计量资料用均数±标准差（）进行描述，完成正态性和方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；不满足正态性和方差齐性的数据采用非参数检验；检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 造模情况 见表1。

造模结束后4 组大鼠戊巴比妥钠协同睡眠试验结果见表1，与空白组相比，造模的3 组大鼠睡眠潜伏时间和睡眠时间与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05），判定模型复制成功。

表1 造模后各组大鼠戊巴比妥钠协同睡眠试验比较（）

表1 造模后各组大鼠戊巴比妥钠协同睡眠试验比较（）

注：与空白组比较，# P ＜0.05

3.2 大鼠的一般情况 造模结束后，空白组大鼠精神状态良好，目光有神，毛发光亮顺滑色白，被抓取时警惕性和反抗较弱。造模的3 组大鼠自造模第3 天起，陆续出现精神萎靡，毛发凌乱，部分发黄开叉，被抓取时警惕性和挣扎力量变弱；造模第6 天起陆续表现出对外界反应的敏感，被抓取时出现攻击行为和易激惹状态，小部分则出现反应迟钝，挣扎力量下降的情况；造模结束时，大部分大鼠表现出强烈的攻击行为和易激惹状态，精神高度紧张，稍有声响即相互撕咬或呈双前肢互相抵制的两两对峙状态，目光焦灼，毛发杂乱、暗黄无光且部分变硬竖起，被抓取时表现出强烈的警惕性和进攻撕咬行为；剩余个别大鼠出现了精神萎靡，四肢无力，明显消瘦的情况；干预结束后，3 组大鼠精神状态均明显好转，毛发颜色基本恢复，其中摩腹组大鼠警惕性、易激惹以及被抓取时攻击性的下降最为明显，模型组次之，拮抗组仍有小部分大鼠未彻底缓解；此外，相互撕咬的情况在干预3 d后完全消失，仅模型组大鼠可偶见有眯眼和片刻的小打闹。

3.3 大鼠旷场实验情况 见表2。

表2 各组大鼠旷场试验结果（）

表2 各组大鼠旷场试验结果（）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

3.4 大鼠高架十字迷宫试验情况 见表3。

表3 各组大鼠高架十字迷宫试验结果（）

表3 各组大鼠高架十字迷宫试验结果（）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

3.5 大鼠脑干内神经递质的水平 见表4。

表4 各组大鼠脑干内神经递质的水平（）

表4 各组大鼠脑干内神经递质的水平（）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

4 讨论

本实验在改良多平台水环境法[5]造模的基础上进行了部分改进。首先，采用塑料圆筒作为鼠箱，一桶一只，可完全避免造模过程中大鼠为创造睡眠环境而相互踩踏下水致死的情况；其次，铁丝网高度可调，大鼠在平台上起身站立即可用双前肢扒住铁丝网，通过网格空隙进食饮水，不会影响日常饲养；第三，造模所需所有材料都可直接购买获得，鼠箱的制作简单易行；第四，每日更换桶内清水并进行清洁消毒，可避免因代谢物滞留产生的问题。

旷场试验是研究动物自发活动与探索行为的试验[6]，可对大鼠的焦虑、抑郁状态及适应环境能力等进行评价[7-8]。运动总路程反映大鼠对新环境的适应程度，二者呈正相关；中央区停留时间反映大鼠的焦虑水平，二者呈负相关[9]；站立次数反映大鼠在陌生环境中的活跃度、兴奋性以及抑郁程度，其与活跃度和兴奋性呈正相关，与抑郁程度呈负相关[10-11]。本实验中，与空白组相比，模型组大鼠在运动总路程和站立次数上均有明显减少（P＜0.05），而在中央区停留时间上无显著差异（P＞0.05），提示与空白组相比，模型组大鼠对新环境的适应力、活跃度和兴奋性均明显降低，而抑郁程度有明显增加，焦虑水平则无明显差异。与模型组相比，摩腹组和拮抗组大鼠在运动总路程和站立次数上均有明显增加（P＜0.05），而在中央区停留时间上无显著差异（P＞0.05），提示与模型组相比，摩腹组和拮抗组大鼠对新环境的适应力、活跃度和兴奋性均明显回升，抑郁程度明显回落，而焦虑水平无明显变化。

高架十字迷宫试验是能确切评估大鼠焦虑状态的稳定方法[12]。主要利用动物对新异环境的探究特性，和对高悬开放臂的恐惧形成矛盾冲突的心理而产生焦虑状态[13]，通过分析OE、OE%、OT 和OT%可反映大鼠的焦虑水平[14-15]。其中，OE%和OT%是关键标准，与大鼠焦虑水平成反比[16]。本实验中，与空白组相比，模型组大鼠的OE 和OE%均有明显减少（P＜0.05），而OT 和OT%差异不明显（P＞0.05）。提示：与空白组相比，模型组大鼠可能产生了一定的焦虑状态。与模型组相比，摩腹组和拮抗组大鼠在OE、OE%、OT 和OT%上均有明显增加（P＜0.05），提示：与模型组相比，摩腹组和拮抗组大鼠的焦虑水平有了明显下降。

人体睡眠和觉醒的产生与维持主要受到脑内的睡眠和觉醒中枢的调控[17]。其中，蓝斑NE 能、中缝背核5-HT 能、黑质DA 能和基底前脑ACH 能等单胺能神经元，是脑内觉醒调节中枢的主要结构，其纤维末梢释放相应的觉醒递质，可直接兴奋对应脑区的活动[18-19]，从而维持觉醒状态。可见，以上神经递质水平的变化，在中枢对睡眠和觉醒状态的调节中起到了重要作用。上述结论在本实验中均得到体现：与空白组相比，模型组大鼠脑干内的DA、NE、5-HT 和ACH的水平均产生了显著变化（P＜0.05）；并且，除了ACH 水平外，摩腹组和拮抗组大鼠脑干内的DA、NE和5-HT的水平与模型组相比也都呈现出显著差异（P＜ 0.05）。据此推测：摩腹手法可能对觉醒中枢内DA、NE 和5-HT 这3 种单胺类神经递质的影响比较明显，从而降低了觉醒中枢对大脑皮质的兴奋作用。此外，脑内单胺能神经元还参与了中枢对情绪的调节，单胺类神经递质浓度的异常与焦虑症和抑郁症的发病密切相关[20-25]。这在本实验中也有相应体现：4 组大鼠之间脑干内DA、NE、5-HT 和ACH 水平的差异，与它们在旷场试验和高架十字迷宫试验中反映出的焦虑和抑郁状态的差异都相互对应。这也从一定程度上证明了本实验结果的可靠性，提示：摩腹手法可通过调节中枢DA、NE、5-HT 和ACH 的水平，对原发性失眠大鼠的焦虑和抑郁状态起到一定的缓解作用。

最后，本实验作为一个子课题，根据总课题的研究目的而设立了拮抗组，可为最终的研究结论提供一定的行为学依据。