分化抑制因子1和3通过Wnt/ β联蛋白和Shh通路共同调节结直肠癌细胞的干性

黄传钟＊，孙艳霞＊，于 悦，陈 韡，陈淑萍，林万松，叶韵斌1，，3

（1.福建医科大学附属肿瘤医院，福建省肿瘤医院，肿瘤免疫学研究室，福建 福州 350014；2.福建医科大学基础医学院，福建 福州 350100；3.福建省肿瘤转化医学重点实验室，福建 福州 350014）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范 围内常见的消化系统恶性肿瘤，在我国的发病率和死亡率呈上升趋势［1］。越来越多的证据表明，CRC干细胞可能在CRC的进展和转移过程中发挥了至关重要的作用。高度的自我更新能力和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的肿瘤干细胞可产生化疗抵抗和癌症转移，从而导致预后不良［2］。从临床角度讲，确定维持细胞干性的分子调控机制从而建立有效的CRC靶向治疗策略是非常必要的。分化抑制因子（inhibitors of differ⁃entiation，Id）属于螺旋-环-螺旋转录因子（helixloop-helix，HLH）家族中的一员，其中 Id1（又名DNA结合抑制因子1）在多种肿瘤组织呈高表达，如前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、卵巢癌［5］、胃癌［6］、食管癌［7］和结直肠癌［8］等，并与癌症的侵袭转移和不良预后具有相关性［9-13］。而Id1已被证实在胚胎干细胞、内皮细胞以及神经干细胞样细胞中具有维持其自我更新的功能［14-15］，同时Id3和Id1具有高度的序列相似性，故在许多组织中具有广泛重叠的生物学功能，它们的功能常被认为是相互促进的［16］。我们前期研究发现，Id3在CRC干细胞特性的维持过程中也同样具有重要作用［17］。最近，O′Brien 等［18］发现，Id1和Id3可通过限制P21驱动的细胞周期来共同调节CRC干细胞的自我更新，但相关信号转导机制尚未完全阐明。本研究通过单敲减和双敲减HCT116的Id1和Id3基因的表达，探索Id3是否协同Id1调控CRC干性及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

CRC细胞HCT116（上海细胞库）。RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（Gibco公司，美国）；d1短发夹RNA质粒（short hairpin RNAId1，shRNA-Id1）、shRNA-Id3和阴性对照质粒慢病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；嘌呤霉素（Merck公司，美国）；Trizol裂解液（Invitrogen公司，美国）；RNA逆转录试剂盒（Promega公司，美国）；Id1、Id3和β肌动蛋白引物（北京梓熙生物科技有限公司）；荧光定量检测试剂盒和化学发光试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；AnnexinⅤ/PI检测试剂盒、BCA法蛋白定量试剂盒、牛血清白蛋白标准品和基质胶（Bio-Rad公司，美国）；NC膜（Amersham公司，美国）；Wnt通路抑制剂FH535、Sonic Hedgehog（Shh）通路抑制剂HPI-1（Abcam公司，美国）；兔抗人β联蛋白单抗、兔抗人八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcrip⁃tion factor 4，Oct4）单抗、兔抗人zeste同源物增强子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）多抗、兔抗人钙黏蛋白转录抑制因子（snail）多抗、兔抗人Shh单抗、兔抗人融合抑制剂（suppressor of fused，SUFU）多抗、兔抗人周期蛋白D1单抗、兔抗人凋亡抑制因子单抗、兔抗人磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphatedehydrogenase，GAPDH）单抗、兔抗人CD24单抗、兔抗人CD133单抗和兔抗人CD44单抗（均Cell Signaling Technology公司，美国）；小鼠抗人Id1多抗和小鼠抗人Id3多抗（Santa Cruz公司，美国）；小鼠抗人富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5）多抗、兔抗人CD166、兔抗人细胞性骨髓细胞瘤病癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-myc）多抗、兔抗人胶质瘤相关癌基因同源蛋白2（glioma-associated oncogene homologue 2，GLI2）多抗和兔抗人Hedgehog受体（PTCH2）单抗（Abcam公司，美国）；兔抗人CD133单克隆荧光抗体、兔抗人CD24单克隆流式抗体及其同型抗体对照（Miltenyi公司，德国）。生物安全柜（哈尔滨市东联电子有限公司），纯水系统（Millipore公司，美国），二氧化碳培养箱（Heraeus公司，德国），荧光定量PCR仪（Roche公司，美国），活细胞工作站（Leica公司，美国），垂直电泳槽、CLD-RAD550型酶标仪（Bio-RAD公司，美国），普通离心机（白洋离心机厂），流式细胞仪（BD公司，美国），凝胶成像分析仪（Panasonic公司，日本），实时无标记细胞分析仪RTCA（ACEA Biosciences公司，美国）。RTCA是基于电阻抗传感器原理的细胞检测，能够实时检测细胞的生长、增殖、毒性、粘附及形态变化等动态生物学反应过程；仪器底部整合有微金电子传感器芯片，当细胞贴壁生长时，可引起电极界面阻抗的改变，该阻抗值的变化直接反映细胞的生物学状态，因此RTCA可在细胞生理状态下，实时、连续、定量跟踪细胞形态和增殖分化的改变。

1.2 细胞培养和敲减细胞株构建

HCT116细胞采用含10% FBS的1640培养液培养，传代后分别加阴性对照质粒（质粒对照组，简称对照组）、Id1敲减质粒（sh-Id1组）、Id3敲减质粒（sh-Id3组）及Id1和Id3双敲减质粒（sh-Id1Id3组），作用12 h后，更换培养液，继续培养48 h后更换为含嘌呤霉素1.5 mg·L-1培养液筛选细胞，每3 d更换1次新鲜的嘌呤霉素抗性培养基。筛选3周后，通过荧光显微镜下观察绿荧光强度确定感染效率。

1.3 实时荧光定量PCR检测肠癌细胞中Id1和Id3 mRNA表达

取1.2构建和分组处理的细胞接种于细胞培养皿，长至融合度约80%时用Trizol液裂解细胞，提取总RNA。用逆转录试剂盒HiScript Q-RT Super⁃Mix，以1 μg RNA为模板合成cDNA。Id1引物：上游为5′-CGTGCTGCTCTACGACATGA-3′，下游为 5′-GCTCCAACTGAAGGTCCCTG-3′；Id3 引物：上游为5′-AGCCAGGTGGAAATCCTAC-3′，下游为5′-AAGCTCCTTTTGTCGTTGG-3′；内参β肌动蛋白引物：上游为5′-TGGCACCA⁃CACCTTCTACA-3′，下游为5′-AGCACAGCCT⁃GGATAGCA-3′。设定反应条件进行实时荧光定量PCR反应，按仪器的实验操作要求设置40个循环，用2-△Ct法计算目标mRNA相对表达水平。

1.4 Western印迹法检测基因敲减的HCT116细胞中Id1和Id3蛋白表达水平

收集1.2构建和分组处理的细胞，用裂解液裂解，冰上孵育15 min，提取细胞总蛋白。用BCA法进行蛋白定量，每组取25 μg裂解蛋白进行凝胶电泳，电转至NC膜。用5% FBS封闭液室温封闭1 h，加Id1和Id3抗体（1∶500），4℃过夜，以GPADH作为内参（1∶2000），用TBST洗3次后加二抗（1∶1000），室温孵育二抗2 h后加TBST洗3次，使用化学发光试剂盒显影。以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度值比值表示目标蛋白表达水平。

1.5 实时无标记细胞检测技术检测细胞生长增殖

取1.2构建和分组的细胞，密度为2×108L-1，加到已检测过基线的E-Plate 16检测板中，每孔加100 μL培养液，室温静置30 min后将检测板置培养箱中的RTCA S16仪器上，取0，24，48和72 h共4个时间点，对细胞增殖进行监测并绘制生长曲线图。

1.6 克隆形成实验检测基因敲减的HCT116细胞克隆数

将1.2构建和分组处理的对数生长期细胞，经胰酶消化后，各取800个接种到6孔板中，12～14 d后，吸弃培养液，PBS轻轻洗3次，甲醇固定30 min，每孔加0.1%结晶紫染液600 μL，染色10 min，PBS轻洗3次，计算克隆数和克隆直径。

1.7 流式细胞术检测基因敲减的HCT116细胞凋亡

收集1.2构建和分组处理的细胞，按AnnexinⅤ/PI凋亡检测试剂盒说明书，用100 μL结合液重悬，后加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和5 μL PI，轻轻混匀，避光室温孵育15 min后上流式细胞仪采集细胞凋亡数据。

1.8 无血清悬浮细胞球培养实验观察基因敲减的HCT116细胞悬浮球的大小和数量

采用极限稀释法，将1.2构建和分组处理的细胞接种于96孔板中，每组5复孔，每孔加200 μL无血清DMEM/F12培养液培养7 d后，显微镜下观察悬浮球的直径和数量。

1.9 流式细胞术检测基因敲减的HCT116细胞CD24和CD133表达

采用直接免疫荧光标记法分析1.2构建和分组处理的细胞中CD24和CD133（CD133/2亚型）的表达，取1×l06对数生长期细胞，加抗CD24和CD133荧光抗体以及相应同型抗体；室温避光反应30 min，每管加1 mL洗液，800×g离心5 min，去上清，沉淀加200 μL洗液混匀后上流式细胞仪采集细胞CD24和CD133表达数据。

1.10 Western印迹法检测基因敲减的HCT116细胞中CD24，CD133，EpCAM，Oct4，EZH2，Lgr5和 β联蛋白表达水平

参照1.4方法，收集1.2构建和分组处理的细胞，进行Western印迹实验，CD24，CD133，EpCAM，Oct4，EZH2，Lgr5和β联蛋白抗体稀释倍数为1∶500，二抗稀释倍数为1∶1 000，使用化学发光试剂盒显影。以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度值比值表示目标蛋白表达水平。

1.11 Western印迹法检测基因敲减的HCT116细胞中c-myc， β联蛋白，SuFu，PTCH2，Shh和GLI2蛋白表达水平

收集1.2构建和分组处理的细胞，用裂解液裂解，冰上孵育15 min，提取细胞总蛋白。加入500 μL细胞裂解液，用吸头上下抽吸数次，冰上孵育15 min，振荡10 s，10 000×g离心5 min，收集上清，此为浆蛋白；再加入500 μL细胞裂解液振荡5 s，离心5 min，弃除上清，加入50 μL萃取缓冲液抽吸数次；4℃孵育30 min，12 000×g离心10 min，收集上清，此为核蛋白。用BCA法进行蛋白质定量，每组取25 μg裂解蛋白进行凝胶电泳，电转至NC膜。用5%FBS封闭液室温封闭1 h，加一抗（1∶500）4℃过夜，用TBST洗3次后加二抗（1∶1000），室温孵育二抗2 h后加入TBST洗3次，使用化学发光试剂盒显影。以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度值比值表示目标蛋白表达水平。

1.12 Western印迹法检测基因敲减HCT116细胞过表达c-myc后CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5蛋白的表达

参照1.2在Id1和Id3敲减的HCT116细胞中构建c-myc过表达细胞株，参照1.4进行Western印迹实验，抗CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5抗体稀释比1∶500，二抗稀释比1∶1000，使用化学发光试剂盒显影。以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度值比值表示目标蛋白表达水平。

1.13 统计学分析

2 结果

2.1 Id1和Id3基因敲减HCT116细胞的构建

通过构建慢病毒载体系统，获得敲减Id1/Id3的HCT116细胞株，经嘌呤霉素筛选3周后，荧光显微镜下观察荧光强度。如图1显示，HCT116对照组、sh-Id1组、sh-Id3组和sh-Id1Id3组细胞绿荧光率均达＞90%，提示慢病毒成功感染细胞。

Fig.1 Construction of HCT116 cells with inhibitor of differentiation 1（Id1）and Id3 gene double-knockdown（×100）.Short hairpin RNA plasmid was used to construct Id1 sin⁃gle gene knockout（sh-Id1），sh-Id3 and double gene knockout（sh-Id1Id3）HCT116 cells by lentiviral transfection system.

2.2 Id1和Id3基因敲减HCT116细胞中Id1和Id3 mRNA水平

如图2所示，与对照组相比，sh-Id1组Id1mRNA水平显著降低（P＜0.01），sh-Id3组Id3mRNA水平显著降低（P＜0.01），sh-Id1Id3组Id1和Id3mRNA水平均显著降低（P＜0.01）。

Fig.2 Id1（A）and Id3（B）mRNA expressions in HCT116 cells with Id1 and Id3 gene knockdown by qRT-PCR.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3 Id1和Id3基因敲减HCT116细胞中Id1和Id3蛋白的表达

如图3所示，与对照组相比，sh-Id1组Id1蛋白表达降低，sh-Id3组Id3蛋白表达降低，sh-Id1Id3组Id1和Id3蛋白表达均显著降低（P＜0.01）。

Fig.3 Protein expressions of Id1（A1，A2） and Id3（B1，B2）in HCT116 cells with Id1 and Id3 gene knock⁃down by Western blotting.IA：intensity analysis.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.4 Id1/Id3敲减对HCT116细胞增殖的影响

实时无标记细胞检测结果（图4）显示，48 h后，与对照组相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组细胞的增殖信号显著减弱（P＜0.05）；与sh-Id1和sh-Id3相比，sh-Id1Id3组的增殖信号亦显著减弱（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of Id1/Id3 knockdown on proliferation of HCT116 cells by real-time cells analysis.See Fig.1 for the cell treatment.Cell proliferation was detected 48 h post-transfection.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group；#P＜0.05，com⁃pared with sh-Id1group；△P＜0.05，compared with sh-Id3 group.

2.5 Id1/Id3敲减对HCT116细胞克隆数量和大小的影响

克隆形成实验结果（图5）显示，与对照组细胞克隆数（411±18）（n=3）相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组细胞克隆数分别下降到185±24，201±20和112±21（n=3）；细胞克隆的平均直径分别由对照组（321±48）μm（n=3）下降到144±14，163±13和（87±9）μm（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组与对照组相比显著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3组与sh-Id1、sh-Id3组相比显著降低（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of Id1/Id3 knockdown on colony-formation of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.6 Id1/Id3敲减对HCT116细胞凋亡的影响

图6结果显示，与对照组凋亡率为（42±4）%相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），分别为（69±6）%，（59±5）%和（80±7）%（n=3）；sh-Id1Id3组细胞凋亡率显著高于sh-Id1和sh-Id3组（P＜0.05）。

Fig.6 Effect of Id1/Id3 knockdown on apoptosis of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.7 敲减Id1/Id3对HCT116细胞成球能力的影响

无血清悬浮细胞球培养结果（图7）显示，与对照组细胞球性形成率（37±2）%相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组细胞球性形成率分别下降到（15±2）%，（18±3）%和（9±2）%（n=3）；干细胞球的平均直径分别由对照组（103±6）μm下降到49±2，55±3和（43±1）μm（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组与对照组相比均显著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3组与sh-Id1和sh-Id3组相比显著降低（P＜0.05）。

Fig.7 Effect of Id1/Id3 knockdown on sphere-formation of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.8 Id1/Id3敲减对HCT116细胞CD133和CD24表达的影响

如图8所示，CD133+细胞比例在对照组、sh-Id1、sh-Id3和sh-Id1Id3组分别为（2.80±0.17）%，（0.50±0.12）%，（0.70±0.12）%和（0.27±0.09）%（n=3）；CD24+细胞比例在对照组、sh-Id1、sh-Id3和sh-Id1Id3组分别为（24.60±2.25）%，（10.90±3.60）%，（12.70±1.13）%和（0.36±0.06）%（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组中CD133+和CD24+细胞比例与对照组相比均显著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3组与sh-Id1和sh-Id3组相比显著降低（均P＜0.05）。

Fig.8 Effect of Id1/Id3 knockdown on stemness of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.9 Id1/Id3敲减对HCT116细胞干性相关蛋白CD24、CD133、EPCAM、Oct4、EZH2、 β 联蛋白、Lgr5表达的影响

Western 印迹结果显示（图9），sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组与对照组相比，CD24、CD133、EPCAM、Oct4、EZH2、β联蛋白和Lgr5蛋白表达均显著性下调（P＜0.05），但 CD166和 CD44未见明显变化。

Fig.9 Protein expressions of CD24，CD133，EPCAM，Oct4，EZH2， β-catinin，CD166，CD44 and Lgr5 in HCT116 cells with Id1/Id3 gene knockdown by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

2.10 Id1/Id3敲减对HCT116细胞Wnt/ β联蛋白和shh通路相关蛋白表达的影响

Western印迹结果显示，与对照组相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组中Wnt/β联蛋白通路关键分子c-myc、细胞质β联蛋白、细胞核内β联蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05）（图10A）；sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3组与对照组相比，Shh通路的关键分子SuFu和PTCH2显著上升，Shh和GLI2显著下降（均P＜0.05）（图10B）。

Fig.10 Id3 and Id1 co-regulate stemness characteristics of colon cancer cells through Wnt/ β-catenin and Shh signaling pathways by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

2.11 Id1/Id3基因敲减HCT116细胞过表达c-myc对CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5蛋白表达的影响

Western印迹结果显示（图11），过表达c-myc后，Id1和Id3被敲减后降低的干性标志物CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5的表达重新上调（均P＜0.05），CRC细胞的干性重新增强，进一步明确了Id3和Id1通过Wnt/β联蛋白、Shh通路共同调控CRC的干性相关蛋白的表达。

Fig.11 Expressions of CD133，Oct4，EZH2，EpCAM and Lgr5 after c-myc overexpression in HCT116 cells with Id1/Id3 gene knockdown by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

3 讨论

本研究发现，在肠癌细胞中敲减Id1和Id3均可通过增加凋亡，从而抑制肠癌细胞的增殖以及克隆形成，且同时敲减Id1与Id3后，肠癌细胞的增殖抑制不仅与对照组相比显著降低，而且与单独敲减组比较显著降低，说明Id1与Id3对HCT116细胞增殖的影响具有叠加作用。

高增殖能力是许多癌症细胞的重要特征之一，与癌症的进展密切相关［19-20］，同时也是肿瘤干细胞的特征之一。肿瘤干细胞具有自我更新能力及增强侵袭、转移、肿瘤形成和增殖的能力等特点，同时具有抗常规放疗和化疗的能力，这些干细胞特性是肿瘤治疗失败的主要原因。本研究采用无血清悬浮培养细胞球的方法，发现HCT116细胞敲减Id1/Id3后细胞成球能力下降，流式细胞术和Western印迹检测均发现CD133和CD24等干性标志物表达更低，并且同时敲减Id1和Id3能显著抑制HCT116细胞的干性特征，表明Id3能协同Id1更好地抑制肠癌进展。

此外，干细胞的调控涉及多种信号通路，如Wnt，Sonic，Hedgehog（Shh）和 Notch 等，它们在多种人类恶性肿瘤中失控，直接导致肿瘤的发生发展。有研究表明，Wnt/β联蛋白信号通路在保持上皮干细胞及CRC干细胞生长和自我更新功能上起至关重要的作用，且Wnt/β联蛋白信号通路的活化可导致EMT和肿瘤转移［21］。同样，Shh在调控胚胎干细胞和成体干细胞中有重要作用［22］。在本研究中敲减Id1/Id3后Wnt/β联蛋白通路和Shh通路上的关键蛋白的表达水平明显下降，这说明Id1/Id3通过Wnt/β联蛋白、Shh通路调控CRC细胞干性相关蛋白的表达。c-myc作为Wnt通路和SHH通路共同的靶基因，参与维持胚胎干细胞的自我更新功能，可诱导Bmi1和EZH2的表达。本研究通过在敲减Id1/Id3的HCT116细胞上过表达c-myc增强了CRC细胞的干性，从而进一步明确了Id3和Id1通过Wnt/β联蛋白、Shh通路共同调控CRC的干性相关蛋白的表达。

肿瘤细胞耐药性的产生是肿瘤治疗的主要障碍之一，而肿瘤干细胞是其耐药的主要机制。抗肿瘤药物一般作用于增殖的肿瘤细胞，而肿瘤干细胞多处于静止期而耐受化疗药物，常常是CRC等恶性肿瘤复发的原因之一。从肿瘤干细胞的角度寻找治疗药物，或降低肿瘤的干性，将肿瘤干细胞标志物作为治疗靶点是解决肿瘤细胞耐药的策略之一［23］。Id1和Id3可以共同调控CRC的干性相关蛋白的表达，可能是CRC耐药的原因之一，将Id1和Id3作为治疗靶点可能是将来肿瘤治疗的有效手段之一。