γ射线辐射对大鼠肝药物代谢酶CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6蛋白表达及药物代谢活性的影响

董 航，张海晖，窦桂芳，孟志云，叶 彤，朱晓霞，顾若兰，吴卓娜，甘 慧

（军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850）

γ射线是一类穿透性极强的射线，机体在短时间内吸收1 Gy以上剂量的γ辐射会引发急性放射病（acute radiation disease，ARD），肝受损后会发生肝功能异常、纤维化等病变，进而严重损害碳水化合物和脂质的代谢，影响机体健康［1-4］。细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）主要存在于肝中，参与70%～80%药物代谢，其中CYP1A2主要参与芳香族化合物、杂环胺、硝基芳香化合物和霉菌毒素等致癌物质的代谢，CYP2C9参与13%～17%临床药物代谢，CYP2D6介导20%～30%处方药物的生物转化［5-8］。有研究发现，辐射可在一定程度上诱导或抑制肝药物代谢酶表达和活性，如双氧铀硝酸盐可显著降低大鼠CYP2C11蛋白表达水平，对CYP1A2和CYP2B1/2表达无显著影响；大鼠全身照射X射线，CYP活性显著降低；UV-B辐射可导致人皮肤组织CYP1A1活性和蛋白表达水平的升高［9-11］。本研究通过观察6 Gy γ射线辐射对大鼠肝代谢酶CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6在蛋白表达和微粒体活性水平的变化，为辐射后机体药物代谢研究及相应临床用药研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

色谱级乙腈、甲酸和甲醇（Fisher Scientific公司，美国）；蔗糖、甘油、磷酸氢二钾、浓盐酸、氯化镁和乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；NADPH再生循环系统和96孔细胞培养板（Corning公司，美国）；普萘洛尔、非那西丁、双氯芬酸、右美沙芬、对乙酰氨基酚、4′-羟基双氯芬酸和右啡烷（Sigma公司，美国）；兔抗大鼠CYP1A2多克隆抗体、兔抗大鼠CYP2C9多克隆抗体和兔抗大鼠CYP2D6多克隆抗体（Biorbyt公司，英国）；小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体和Western印迹相关试剂（北京普利莱基因技术有限公司）；BCA蛋白检测试剂盒（Thermo公司，美国）。

1.2 实验仪器

EIX800酶标仪（Bio-Tek公司，美国）；Advan⁃tage A10超纯水仪（Mili-Q公司，美国）；3-18k型台式高速冷冻离心机（Sigma公司，德国）；GHP-9080隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；5200显影仪（Tanon）；KQ-300 DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME235S电子天平（长沙湘平科技发展有限公司）；ES-2001P电子pH计（Sartorious，美国）；HZS-H-S水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；MS-H-S磁力搅拌器（SCILOGEX，美国）；XHF-D高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CP-NX超速离心机（Himac公司，日本）；液相色谱（资生堂公司，日本）；API 4000-质谱（AB Sciex公司，美国）。

1.3 辐照和分组

28只SPF级雄性Wistar大鼠，体重180～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养于军事医学研究院，温度21～25℃，12 h昼夜交替照明，适应性饲养3 d，自由饮食饮水。大鼠随机平均分为正常对照组和辐射组，每组14只，其中6只用于肝总蛋白提取和组织病理观察，8只用于肝微粒体药物代谢分析。辐射组大鼠于饲养第4天给予总剂量6 Gy的单次全身照射，剂量率为68.34 cGy·min-1，辐射距离为4 m。辐射源为军事科学院军事医学研究院钴源照射中心60Co。所有动物实验经军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所伦理委员会批准且实验均按照相关指导原则和规定进行。实验结束，颈椎脱臼法处死大鼠，取肝组织分别制备用于病理观察、蛋白表达和活性观察的切片、肝总蛋白和肝微粒体。

1.4 HE染色观察肝组织病理变化

辐射后24 h，取1.3分组大鼠（每组6只）切取肝组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片制成组织薄片，苏木素染液、伊红染液染色后显微镜下200倍视野进行图像采集，并进行病理学分析。

1.5 Western印迹法检测肝组织CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6蛋白表达水平

辐射后24 h，取1.3分组大鼠（每组6只），处死后取肝组织约0.1 g，RIPA法提取肝总蛋白，肝总蛋白按4∶1比例加入5×蛋白上样缓冲液，100℃变性15 min。配制10%的SDS-PAGE分离胶，每孔上样量为20 μg，电泳浓缩胶阶段为恒压80 V，分离胶阶段为恒压120 V。电泳结束后转移至PVDF膜上，电转条件为电流200 mA，2 h。PVDF膜首先于5%的脱脂奶粉室温封闭2 h后；4℃过夜孵育一抗，抗体稀释比例分别为CYP1A2抗体（1∶800）、CYP2C9抗体（1∶2000）、CYP2D6抗体（1∶1000）、GAPDH抗体（1∶5000）；室温孵育二抗1 h，二抗稀释比例均为（1∶5000）。用软件Image J对蛋白条带积分吸光度值进行半定量分析，以目的蛋白条带与内参蛋白条带积分吸光度比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.6 液质联用法检测体外孵育药物浓度

1.6.1 肝微粒体的提取

辐射后24 h，取1.3分组大鼠（每组8只），颈椎脱臼法处死，迅速打开腹腔和胸腔，暴露肝门静脉、下腔静脉，通过肝门静脉迅速推注预冷的生理盐水，并剪开下腔静脉使液体顺畅流出，每只大鼠灌流量约为200 mL，灌流程度以血液被冲洗干净，肝完全变为土黄色为准。梯度离心法分离微粒体，取适量肝组织按重量体积比1∶3（W/V）加入0.25 mol·L-1冷蔗糖溶液，充分匀浆，匀浆液于12000×g转速4℃离心20 min，将上清液转移至超速离心机，4℃温度下100 000×g离心60 min，弃去上清，粉红色沉淀即为肝微粒体。按照1∶1（W/V）比例加入冰TMS缓冲液重悬微粒体，用预冷的玻璃匀浆器研磨均匀后，向肝微粒体溶液中加入甘油至甘油终浓度为20%，充分混匀后分装，于-80℃冻存待用。提取过程中尽量保持低温并通氮气以维持低氧环境，防止微粒体氧化失活。

1.6.2 体外药物代谢孵育

将CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6代谢酶的特异性底物混合后，与每只大鼠肝脏微粒体分别进行体外孵育，液质联用仪检测相应标志性代谢产物的生成量以反映各亚型酶在微粒体水平酶的活性高低。每只大鼠肝微粒体孵育体系为1 mL，含微粒体样本（终浓度为0.6 g·L-1）、非那西丁（终浓度为10 μmol·L-1）、双氯芬酸（终浓度为10 μmol·L-1）、右美沙芬（终浓度为 5 μmol·L-1），NADPH再生系统150 μL，以及K2HPO4缓冲液。终止液为含内标0.02 μmol·L-1普萘洛尔的乙腈。在反应进行至第5，10，20和40 min时，从孵育体系中取出80 μL混合反应物，等体积加入终止液，充分震荡以终止反应。HPLC-MS/MS定量分析，以标志性代谢产物的生成来反映酶代谢活性水平。

1.6.3 液质联用法检测

API 4000液质联用仪在ESI正离子模式下，检测CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6酶标志性代谢反应物（对乙酰氨基酚、4′-羟基双氯芬酸和右啡烷）的生成量，以下液相条件优化自Wang等［12］的方法，并经过实验检验，此法稳定、可靠。采用CAPCELL PAK C18色谱柱（2.0 mm×50 mm，5 μm）进行液相分离，液相条件为：流动相A：乙腈（0.1%甲酸），流动相B：水（0.1%甲酸）；洗脱梯度依次为0～0.5 min（2%A），0.5～2 min（2%A～40%A），2～3.5 min（40%A～90%A），3.5～4.3 min（90%A），4.3～6.0 min（2%A）；流速为300 μL·min-1；洗脱时间为6 min；进样量5 μL。质谱条件如下：离子喷雾电压5500 kV、碰撞气压12 psi、气帘气压20 psi、离子源气体一60 psi、离子源气体二20 psi、温度 500℃。质谱检测参数见表1。

Tab.1 Mass spectrometry parameters for compound analysis

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 γ射线辐射对大鼠肝组织的损伤

6 Gy γ射线全身照射大鼠，正常对照组肝组织切片显示（图1），肝小叶中央为中央静脉，周围是大致呈放射状排列的肝细胞和肝血窦，肝细胞圆润、饱满；肝板排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压；相邻肝小叶之间的门管区无明显异常；未见明显炎症。辐射组大鼠病理切片显示，肝实质内可见大量的肝细胞变性，胞质疏松淡染（黑色箭头），局部髓窦轻度扩张（蓝色箭头），且有肝板增粗现象。组织染色结果提示6 Gy γ射线对大鼠肝脏造成了一定程度的病理生理损伤。

Fig.1 Pathologic changes in liver tissue of 6 Gy irra⁃diated irradiation rats(HE，×200).Livers in irradiation group were prepared at 24 h after irradiation.The blue arrow shows the area of hepatocyte degeneration,and the black arrows show the area of the dilation of medullary sinus.

2.2 γ射线辐射对大鼠肝组织CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6蛋白表达的影响

Western印迹法结果（图2）显示，辐射后CYP1A2蛋白表达量平均值较正常对照组显著升高82.8%（P＜0.05），辐射组大鼠肝CYP1A2蛋白的最高表达量为正常对照组最高表达量的1.48倍。6 Gy γ射线辐射使大鼠肝CYP2C9蛋白相对表达量平均值较正常对照组蛋白相对表达量平均值上升87.9%。而相对于正常对照组CYP2D6蛋白表达量，辐射组大鼠肝CYP2D6蛋白相对表达无明显变化。

Fig.2 Effect of 6 Gy γ-ray on protein expressions of hepatic CYP1A2，CYP2C9 and CYP2D6 after irradiation.Protein samples of the two groups were prepared from livers of rats 24 h after irradiation.Western blotting analyses for CYP450 subtypes protein were carried out with total hepatic proteins per lane（20 μg of each）.The sample of each lane was prepared from an individual rat.B-D：relative level of CYP1A2，CYP2C9 and CYP2D6，the semi-quantitative results of A.±s，n=6，＊P＜0.05，compared with normal control group.

2.3 γ射线辐射对大鼠肝组织CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6酶活性的影响

2.3.1 辐射对CYP1A2药物代谢活性的影响

对乙酰氨基酚药物浓度-时间曲线（图3A）结果显示，孵育体系中的代谢产物浓度在40 min内随时间的增加而增加。图3B显示，40 min时辐射组生成的CYP1A2特异性代谢产物较正常对照组升高33.9%（P=0.055）。

Fig.3 Effect of 6 Gy γ-ray on activity of rat hepatic CYP1A2 after irradiation.Rats in irradiation group were irra⁃diated by 6 Gy γ-ray.Microsomes were prepared from livers of rats 24 h after irradiation.The activity of CYP1A2 in hepatic mi⁃crosomes was indicated by the metabolism of substrate phenace⁃tin.The metabolite paracetamol was quantitated with HPLC-MS/MS method.A：concentration of metabolite paracetamol at dif⁃ferenttime points ofincubation;B：relative production of paracetamol after CYP1A2 metabolism in 40 min.±s，n=8.

2.3.2 辐射对CYP2C9药物代谢活性的影响

CYP2C9特异性底物双氯芬酸与2组大鼠肝微粒体代谢孵育，如图4A显示，CYP2C9代谢标志性反应物4′-羟基双氯芬酸浓度在40 min内随时间的增加而增加。在40 min内，与正常对照组相比，辐射组孵育体系中4′-羟基双氯芬酸的生成量增加33.1%，显著升高（P=0.022）（图4B）。表明相对于正常对照组大鼠，6 Gy γ射线辐射对大鼠肝CYP2C9酶代谢活性有显著性诱导作用。

Fig.4 Effect of 6 Gy γ-ray on activity of rat hepatic CYP2C9 at 24 h after irradiation.See Fig.3 for the rat treat⁃ment.The activity of CYP2C9 in hepatic microsomes was indi⁃cated by the metabolism of substrate diclofenac.The specific metabolite 4′-hydroxydiclofenac was quantitated by HPLC-MS/MS method.A：concentration of metabolite 4′-hydroxydiclofenac at different time points of incubation.B:relative production of 4′-hydroxydiclofenac CYP2C9 metabolism in 40 min.±s，n=8.＊P＜0.05,compared with normal control group.

2.3.3 辐射对CYP2D6药物代谢活性的影响

6 Gy γ射线照射大鼠后，如图5A所示，以右美沙芬为特异性底物，CYP2D6代谢后标志性反应物-右啡烷在孵育体系中的浓度在40 min内随时间的增加而增加，提示CYP2D6体外代谢孵育体系建立成功，但是辐射组大鼠微粒体代谢生成右啡烷的速度与正常对照组无明显差异；且在40 min内，体系中右啡烷的相对生成量与正常对照组相近（图5B）。以上结果提示，6 Gy γ射线辐射对大鼠肝CYP2D6代谢酶活性无明显影响。

Fig.5 Effect of 6 Gy γ-ray on activity of rat hepatic CYP2D6 at 24 h after irradiation.See Fig.3 for the was rat treatment.The activity of CYP2D6 in hepatic microsomes was indicated by the metabolism of substrate dextromethorphan.The metabolite dextrorphan was quantitated by HPLC-MS/MS method.A：concentration of metabolite dextrorphan at different time points of incubation;B：relative production of dextrorphan CYP2D6 metabolism in 40 min.±s，n=8.

3 讨论

机体中CYP450酶主要存在于肝，部分肝外细胞也有分布。肝结构和功能的完整程度一定程度上决定着机体对药物的代谢能力，而肝也是对辐射敏感的器官之一。本研究采用HE染色进行肝组织病理分析，Western印迹法研究辐射对大鼠CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6在肝蛋白表达水平上的影响，并用HPLC-MS/MS检测其在微粒体水平活性变化。研究结果表明，6 Gy γ射线辐射导致肝脏病变；CYP1A2和CYP2C9在辐射后蛋白表达显著上升，而CYP2D6则无明显变化；同时大鼠肝CYP1A2，CYP2C9和CYP2D6代谢活性出现不同程度变化，其中CYP1A2，CYP2C9经辐射后活性水平均有上升趋势，而CYP2D6活性在辐射前后无明显变化。

本研究结果表明，6 Gy γ射线辐射对3种代谢酶亚型在蛋白水平和微粒体酶活性水平上的变化规律一致，辐射后CYP1A2和CYP2C9蛋白表达与药物代谢活性均升高，而CYP2D6几乎未受影响。由于酶的代谢能力的升高在一定水平上是由酶含量的增加引起的，辐射后CYP1A2和CYP2C9在微粒体活性水平的升高一定程度上反映蛋白表达的增加。同时发现，辐射后二者的蛋白升高程度与微粒体活性水平升高程度并不完全相同。首先这可能是由于活性检测和蛋白检测方法的灵敏度不同导致的；其次，酶的活性发挥一定程度上取决于酶的反应环境和条件，体外反应与体内反应存在较大区别；最后酶的活性还取决于酶的三维结构所构建的活性中心，蛋白转录翻译后修饰也是活性的重要因素，而辐射是否会对酶的蛋白结构产生影响，这有待于进一步实验验证。同时发现组内动物CYP450亚型蛋白表达量和酶活性个体差异较大。经过统计分析与比较，辐射后CYP450亚型蛋白水平变化更为显著，CYP1A2和CYP2C9表达平均增加80%以上，二者体外代谢活性在辐射后上升约33%，这与不同实验方法的原理与灵敏度有关，也与体内蛋白在基因、蛋白、活性递进层面上的时序性相关。此外，6Gy γ射线辐射后，大鼠肝CYP1A2在微粒体酶活性水平上较正常对照组有升高现象，但没有显著统计学差异，可能源于肝微粒体提取、Western印迹杂交整个操作流程较复杂，耗时较长，以及动物个体差异的影响。

本研究前期开展了文献调研［13-14］及对辐射剂量、检测时间的实验摸索，提示1～2 Gy剂量对CYP450亚型影响较小；9 Gy高剂量快速影响大鼠血象和生存率，且细胞凋亡坏死导致酶蛋白表达系统受损；5～7 Gy γ射线辐射对于CYP450酶亚型影响是拐点。尽管肝组织病理结果提示辐射后的病理生理进程及细胞凋亡等现象或许仍在继续进行，但辐射后24 h是代谢酶辐射应激的一个较显著的时间点，CYP450代谢酶可能成为辐射生物标志物新的选择。研究利用6 Gy γ射线全身辐射大鼠，在辐射后24 h发现肝组织产生细胞变性，CYP1A2和CYP2C9蛋白表达和药物代谢活性不同程度的升高，提示针对由CYP1A2和CYP2C9代谢的药物，受到γ射线辐射的人群可能更要监测体内代谢酶水平的改变。CYP1A2和CYP2C9升高时，对应的药物需要考虑增加剂量或服药频率以达到良好的药效；针对由CYP2D6代谢的药物，动物水平结果显示，γ射线对CYP2D6无显著诱导或抑制作用，提示临床上对放疗患者CYP2D6代谢酶水平的关注度或许可以略低。由于CYP1A2能将环境中的多环芳香烃激活为有毒物质，辐射对CYP1A2的诱导作用是否会对机体产生除辐射损伤外的二次损伤，也值得在今后实验中进一步探讨。