双氢青蒿素通过抑制蛋白激酶B和NF- κB P65磷酸化减轻缺血再灌注导致的小鼠心肌损伤

崔勤涛，王学惠，刘永强，刘晓晨，段长恩

（新乡医学院第一附属医院1.心血管外科，2.心血管内科，河南 新乡 453100）

心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）是指长时间的心肌缺血导致心功能、心肌代谢、心肌超微结构损伤，而心肌恢复正常灌注后，心肌损伤没有减轻反加重的过程，严重时可导致心律失常而发生猝死［1-3］。I/R损伤多发于心、脑、肝、肺和肾等器官，心肌I/R损伤时炎症反应和氧化应激可导致心肌组织损伤严重。因此，降低炎症反应和氧化应激可缓解I/R后引起的心肌损伤［4］。目前，针对I/R损伤的治疗方法主要有中医治疗、中西医结合治疗和基因治疗［5-6］。双氢青蒿素（dihydroartemis⁃inin，DHA）是青蒿素的衍生物，具有活性高、水溶性强等特点，常被用于治疗疟疾、肿瘤和炎症等疾病［7］。研究表明，DHA可通过抗炎、抗细胞凋亡、抗氧化应激等在肿瘤和免疫性疾病中发挥重要调控作用［8-10］。本研究通过制备小鼠心肌I/R模型，观察DHA对I/R小鼠心肌氧化应激和损伤的影响，并探索其作用机制，为DHA在心肌I/R损伤中的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

DHA（纯度≥98%），成都格利普生物科技有限公司；肌红蛋白（myoglobin，Mb）、心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；苏木精-伊红（HE）和末端标记法（TUNEL）染色试剂盒，美国Sigma公司；兔抗小鼠Bax、Bcl-2、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、NF-κB P65单克隆抗体和辣根过氧化物酶（horse⁃radish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体，美国Pierce公司。研磨仪和载玻片（KZ-Ⅱ，G6004），武汉赛维尔生物科技有限公司；病理切片机（RM2016），上海徕卡仪器有限公司；组织摊片机（KD-P），浙江金华市科迪仪器设备有限公司；酶标仪（RT-6100）、脱色摇床（TSY-B）和电泳仪（Mini-PROTEAN3），美国伯乐公司；台式高速离心机（D3024R），大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；凝胶成像系统（Tanon-1600R），上海天能科技有限公司；光学显微镜（Nikon Eclipse E100），日本尼康公司。

1.2 动物、模型制备和分组

50只6～8周龄雄性BALB/c小鼠，体重25～30 g〔北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2017-0011，使用许可证号SYXK（沪）2017-0014〕。饲养环境，室温20～25℃，室内湿度50%～60%，白天和黑夜交替进行，独自摄食、饮水。50只小鼠随机分为5组，每组10只，分别为假手术组、I/R模型组、I/R+DHA 12.5，25.0和50.0 mg·kg-1组。采用左冠状动脉前降支结扎法制备心肌I/R小鼠模型，ip给予1%戊巴比妥钠麻醉小鼠。气管插管后，在小鼠胸骨第3和4肋间做手术切口，暴露心脏，在显微镜下确定冠状动脉左前降支部位后，采用带线缝合针于左心耳下缘1 cm处穿线结扎。假手术组不结扎加压，I/R+DHA组参照文献［11］在结扎前20 min分别ig给予DHA 12.5，25.0和50.0 mg·kg-1。假手术组和模型组同时ig给予等量生理盐水。连续给药7 d，每天1次。7 d后检测心率（heart rate，HR）、左心室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）和左室收缩末期容积（left ventricular end-systolic volume，LVESV）水平。检测完毕后，处死小鼠，收集心肌和外周血用于后续实验。部分心肌组织用液氮保存防止RNA降解，剩余组织用4%多聚甲醛固定。颈动脉血经4℃，1408×g离心15 min后收集上层血清，并于4℃冰箱中保存。

1.3 用试剂盒检测心肌组织SOD活性和MDA含量

取1.2分组处理的各组小鼠心肌组织，组织匀浆后，4℃，1408×g离心10 min取上清，按照试剂盒说明书检测SOD活性和MDA含量。

1.4 ELISA检测血清中Mb，cTnI和CK-MB含量

取1.2分组收集的血清，采用ELISA试剂盒检测Mb，cTnI和CK-MB含量。

1.5 HE染色检测心肌组织病理变化

取1.2分组处理的小鼠心肌组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，经脱蜡、水化后，进行HE染色；光镜下拍照并观察记录组织病理变化。

1.6 TUNEL染色观察细胞凋亡

取1.2分组处理的小鼠心肌组织，按TUNEL染色试剂盒说明书进行TUNEL染色；凋亡细胞即阳性细胞在光镜下呈棕黄色或棕褐色，非凋亡细胞即阴性细胞呈蓝色。随机选取10个高倍视野计算心肌细胞凋亡率（凋亡细胞核/总细胞核×100%）。

1.7 Western印迹法检测心肌组织Bax和Bcl-2蛋白表达及Akt和NF- κB P65磷酸化水平

取1.2分组处理的各组小鼠心肌组织研磨均匀，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取组织总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定心肌组织蛋白质浓度，经SDS-PAGE电泳、转模、脱脂奶粉封闭，加兔抗小鼠Bax（1∶200），Bcl-2（1∶200），Akt（1∶500）和NF-κB P65（1∶500）单克隆抗体（一抗），4℃孵育摇床过夜。回收一抗，加HRP标记的山羊抗兔（IgG）抗体（二抗）（1∶10000），室温孵育120 min。采用ECL进行化学发光法于暗室下曝光显影。将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件分析吸光度值。以目标条带与内参条带积分吸光度比值表示Bax和Bcl-2蛋白表达水平，p-Akt/Akt和 p-NF-κB P65/NF-κB P65 比值表示磷酸化水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 双氢青蒿素对心肌I/R损伤小鼠心功能的影响

如表1所示，与假手术组比较，I/R模型组小鼠HR和LVEF显著降低（P＜0.01），LVESV显著升高（P＜0.01）。与I/R模型组比较，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1组小鼠HR，LVEF和LVESV均无明显差异；I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1组小鼠HR和LVEF均显著升高（P＜0.05，P＜0.01），LVESV显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of dihydroartemisinin（DHA） on heart rate（HR），left ventricular ejection fractions（LVEF）and left ventricular end-systolic volume（LVESV）of mice with myocardial ischemia/reperfusion（I/R）injury

2.2 双氢青蒿素对心肌I/R损伤小鼠心肌细胞中SOD活性和MDA含量的影响

如表2所示，与假手术组比较，I/R模型组小鼠心肌细胞中SOD活性显著降低（P＜0.01），MDA含量显著升高（P＜0.01）。与I/R模型组比较，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1组小鼠心肌细胞中SOD和MDA含量无明显差异；I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1组小鼠心肌细胞中SOD含量显著升高（P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）。

Tab.2 Effect of DHA on superoxide dismutase（SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content of mice with myocardial I/R injury

2.3 双氢青蒿素对心肌I/R小鼠血清Mb，cTnI和CK-MB含量的影响

如表3所示，与假手术组比较，I/R模型组小鼠血清cTnI，Mb和CK-MB含量均显著增高（P＜0.01）。与I/R模型组比较，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1组小鼠血清cTnI，Mb和CK-MB含量均无明显差异，I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1组其含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.3 Effect of DHA on cardiac troponin I（cTnI），myo ⁃globin（Mb）and creatine kinase isoenzymes（CK-MB）content of mice with myocardial I/R injury

2.4 双氢青蒿素对心肌I/R小鼠心肌组织结构的影响

如图1所示，假手术组小鼠心肌组织形态正常，无炎性浸润。与假手术组比较，I/R模型组小鼠心肌组织形态紊乱，炎性浸润严重。与I/R模型组比较，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1组小鼠心肌组织形态紊乱，炎性浸润严重，可见大量断裂的心肌纤维；I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1组小鼠心肌组织形态趋于正常，未见炎性浸润，少见断裂的心肌纤维。

2.5 双氢青蒿素对心肌I/R小鼠心肌细胞凋亡的影响

如图2A所示，假手术组小鼠心肌组织形态正常，未见凋亡细胞。与假手术组比较，I/R模型组小鼠心肌组织形态紊乱，可见大量凋亡细胞（深棕色或褐色）。与I/R模型组比较，I/R+DHA12.5 mg·kg-1组小鼠心肌组织形态紊乱，可见大量凋亡细胞；I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1组心肌组织形态趋于正常，仅见极少凋亡细胞。I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1组细胞凋亡率为（34±6）%和（21±4）%，较I/R模型组（78±9）%显著降低（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of DHA on cardiomyocyte apoptosis of mice with myocardial I/R injury.See Tab.1 for the mouse treat⁃ment.Arrows show apoptotic cells.

2.6 双氢青蒿素对心肌I/R小鼠心肌组织Bax和Bcl-2蛋白表达及Akt和NF- κB P65磷酸化水平的影响

如图3所示，与假手术组比较，I/R模型组小鼠心肌组织中Bax蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Akt和NF-κB P65磷酸化水平显著升高（P＜0.01）。与I/R模型组比较，I/R+DHA 12.5 mg·kg-1组小鼠心肌组织中Bax和Bcl-2蛋白表达及Akt和NF-κB P65磷酸化水平均无明显差异，I/R+DHA 25.0和50.0 mg·kg-1组Bax蛋白水平显著降低，Bcl-2蛋白水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01），Akt和NF-κB P65磷酸化水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.3 Effect of DHA on protein expressions of Bax and Bcl-2，phosphorylation level of Akt and NF- κB P65 in myocardial tissue of mice with myocardial I/R injury by Western blotting.B was the semi-quantitative result of A；D and E was the semi-quantitative result of C，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，P＜0.01，compared with I/R model group.

3 讨论

HR和LVEF是评测心肌功能的重要指标。在一定范围内，HR越小说明心肌功能越差，反之越好。而LVEF则反映心肌衰竭程度及心肌收缩能力，LVEF与LVESV呈负相关性，LVEF水平越高说明心肌收缩能力越强［12-13］。本研究结果显示，经DHA处理后，心肌I/R模型小鼠心功能明显好转，且HR和LVEF水平明显升高，LVESV水平明显降低。同时，DHA治疗后，I/R模型小鼠心肌组织病理损伤明显改善。提示DHA可改善心肌I/R小鼠心肌功能。

本研究结果显示，DHA可降低心肌I/R模型小鼠心肌组织中SOD活性，升高MDA含量。氧化应激是导致心肌功能损伤的主要原因，心肌I/R发生时，心肌缺血得到暂时的缓解，心肌I/R前由于缺血促使有氧代谢旺盛并产生大量氧自由基，诱发机体生成氧化应激中间产物MDA和ROS等，加重心肌损伤。SOD是抗氧化金属酶，在氧化应激与抗氧化平衡中扮演至关重要的角色。研究报道，DHA通过抑制SOD活性、提高MDA含量调节心肌I/R大鼠氧化应激水平［14］。结合本研究结果提示，DHA通过抑制心肌I/R小鼠氧化应激缓解心肌功能损伤。

本研究结果显示，DHA可减少心肌I/R小鼠心肌组织细胞凋亡，同时降低Bax/Bcl-2蛋白比值。Zhao等［15］发现，心肌长时间缺血或I/R均可诱发心肌组织细胞凋亡和坏死，而Bcl-2家族在这一过程中起主导作用。本研究结果与该报道相符，提示DHA通过抑制凋亡蛋白Bax/Bcl-2表达缓解心肌I/R诱发的心肌细胞凋亡和坏死，减轻心肌I/R损伤。

本研究结果发现，DHA可显著降低心肌I/R模型小鼠心肌组织p-Akt和p-NF-κB P65蛋白表达。研究报道，DHA通过调节Akt和NF-κB表达在多种疾病中发挥作用，如DHA通过抑制PI3K/Akt和NF-κB表达预防小鼠结肠炎［16］，通过降低Akt磷酸化及Akt/mTOR信号通路诱导自噬抑制食管癌的迁移［17］，通过减轻PI3K/Akt通路蛋白水平调节纤维细胞增殖和分化缓解肾纤维化［18］。同时，戴文琴等［19］研究发现，心肌I/R后NF-κB被激活，导致下游炎症因子大量释放，增加心肌损伤程度。也有文献报道，Akt和NF-κB磷酸化是加重心肌I/R损伤的重要原因［20-21］。结合上述研究报道提示，DHA通过下调Akt/NF-κB通路蛋白表达改善心肌I/R模型小鼠心肌损伤，其具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，DHA改善心肌I/R小鼠心功能和心肌病理损伤，缓解心肌组织氧化应激和细胞凋亡，其机制可能与抑制Akt和NF-κB P65磷酸化有关。