沙格雷酯和卡比多巴联合用药对顺铂诱导小鼠急性肾损伤的保护作用

关 晶＊，童 欣＊，张 怡，徐 凡，张誉馨，梁秀睿，金佳琦，敬泓滟，郭柳纤，倪欣睿，傅继华

（1.中国药科大学基础医学与临床药学学院生理学系，江苏 南京 210009；2.中国药科大学理学院，江苏 南京 211198）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是指肾功能在较短时间内下降，导致血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（creatinine，CRE）浓度增加以及出现蛋白尿［1］。除急性期的肾功能障碍外，AKI还存在持续组织损伤的显著风险，导致肾小球滤过率持续下降，肾功能无法恢复，进而发展成慢性肾病［2］。肾作为各种化学药物毒性作用的主要器官，临床上经常发生AKI。顺铂在肾近端小管细胞中积累，临床上约1/3患者出现AKI［3］。研究发现，AKI的发生主要是因顺铂使肾细胞出现氧化应激、线粒体功能障碍、炎症和细胞凋亡［4-5］；使线粒体呼吸链受损，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多［5］。顺铂导致细胞损伤的机制尚未阐明。

有研究报道，5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）参与肾的病理状态。肾近端小管细胞可高水平表达芳香族L-氨基酸脱羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）［6］。该酶可将 5-羟色氨酸脱羧变成5-HT，生理条件下通过旁分泌调节肾中磷酸盐排泄。5-HT的合成正是在色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase，Tph；外 周 为 Tph1）、AADC的2步催化下完成［7］。研究表明，5-HT高水平合成可导致慢性肾病并发尿毒症［8］，还参与糖尿病肾病的发生。在人系膜细胞，5-HT作用于5-HT2A受体（5-HT2Areceptors，5-HT2AR）后产生大量ROS［9］，通过调节下游细胞因子的表达，引起组织炎症、损伤和坏死［10］。5-HT2AR拮抗剂盐酸沙格雷酯（sarpogrelate hydrochloride，SH）对糖尿病肾病小鼠的血糖、肾功能、肾组织损伤均有明显改善作用［11］；SH可显著延缓糖尿病肾病的发展［12］。肾细胞中还存在单胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAO-A），参与内源性和外源性胺的脱氨基作用［13］和肾中ROS的产生［14-15］。我们前期研究发现，外周5-HT系统与胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝、血脂紊乱、炎症反应及糖尿病性疲劳等慢性代谢性疾病密切相关［16-18］。本研究采用顺铂诱导的AKI小鼠模型，研究5-HT2AR拮抗剂SH及5-HT合成抑制剂卡比多巴（cardidopa,CDP）对顺铂引起的肾组织氧化应激、炎症和细胞凋亡的影响，评估SH和CDP对顺铂致肾毒性的预防作用。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

顺铂（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），SH（上海乾劲化工科技有限公司），CDP（浙江手心制药有限公司）。CRE、BUN、白蛋白（albumin，Alb）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（南京建成生物研究所）；BCA试剂和Hoechst染料（上海碧云天生物技术研究所）；ROS、5-HT、多巴胺（dopa⁃mine，DA）、白细胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；小鼠抗小鼠MAO-A单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology）；兔抗小鼠Bcl-2、Bax、活化胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9多克隆抗体（沈阳万类生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG抗体（Biosharp生物科技有限公司）。TGL-16gR高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；Bio-Rad Mini-Protean®Tetra System蛋白电泳设备和Bio-Rad Mini Trans-Blot转印槽（新加坡Bio-Rad公司）；Infinite M200 Pro全波长酶标仪（瑞士Tecan公司）；IX51型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；Tanon 5200 Multi全自动化学发光系统（上海天能有限公司）；激光共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）。

1.2 AKI模型制备和分组

72只雄性6～8周龄清洁级ICR小鼠（扬州大学动物医学比较中心），体重22～25 g，许可证号：SCXK（苏）2017-0007。动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。小鼠正常饲养管理，环境温度24～26℃，湿度50%～55%，光照12 h，黑暗12 h。

依据本实验室前期研究，联合给药时SH∶CDP=2∶1疗效最佳；该SH和CDP比例接近等摩尔剂量（SH和CDP相对分子质量分别为465和226）、疗效有协同效应［16，18］。小鼠适应性饲养 1 周后，按体重均衡的原则随机分为6组，每组12只：正常对照组、模型组、模型+SH 50 mg·kg-1组、模型+CDP 25 mg·kg-1组、模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1组、模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组。各给药组首先预防性ig给药7 d，每天2次（间隔12 h给药1次），正常对照组和模型组给予等体积溶剂（0.5%CMC-Na溶液），7 d后除正常对照组外，其余小鼠ip给予顺铂25 mg·kg-1诱导AKI，继续给药3 d，于造模后72 h将小鼠用戊巴比妥钠麻醉后处死，收集血液和肾组织。1800×g离心10 min收集血清，肾组织用4%甲醛固定或-80℃保存待测。实验数据统计时，剔除死亡小鼠（模型组2只，CDP 25 mg·kg-1组1只）和未表现AKI的小鼠（特征是肾外观颜色与模型组相比无改变，且血清CRE和BUN升高不明显；除模型组外每组出现1～2只）。

1.3 酶标法检测小鼠血清BUN、CRE和Alb含量及肾组织MDA含量和SOD活性

取1.2分组制备的血清和肾组织，肌氨酸氧化酶法测定血清CRE含量，脲酶法测定血清BUN含量，溴甲酚绿法测定血清Alb含量，硫代巴比妥酸法测定肾组织MDA含量和羟胺法测肾组织SOD活性。

1.4 ELISA检测肾组织中ROS，5-HT，DA，TNF- α和IL-1 β水平

从-80℃冰箱内取出1.2制备的肾组织标本，在冰上用小剪刀剪取肾组织，按肾组织：生理盐水=1∶9（V/V）的比例制备10%肾组织匀浆。按试剂盒说明书，ELISA测定小鼠肾组织匀浆中ROS，5-HT，DA，TNF-α和IL-1β水平。

1.5 HE染色观察肾组织病理损伤

取1.2分组制备的肾组织，按常规方法进行组织脱水、透明、浸蜡和包埋。切成3 μm厚切片，经脱蜡、梯度乙醇和HE染色，中性树胶封片。通过IX51型荧光倒置显微镜观察并拍照。

1.6 Hoechest33342荧光染色检测小鼠肾组织细胞凋亡

取1.2分组制备的肾组织，固定后石蜡包埋，以3 μm切片。激光共聚焦显微镜（激发波长350 nm，发射波长460 nm）DAPI通道（蓝色荧光）观察并拍照。

1.7 Western印迹法检测小鼠肾组织中MAO-A、Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9蛋白表达水平

取1.2分组制备的肾组织，肾组织RIPA裂解后离心，取上清液；BCA法测蛋白浓度，上样缓冲液后进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜；BSA封闭后加入对应的一抗（Tph1，1∶1000；AADC，1∶700；5-HT2AR，1∶500；MAO-A，1∶500；活化胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶 9、Bcl-2和Bax，1∶500），于4℃孵育过夜，TBST清洗；加入山羊抗兔IgG抗体（1∶40 000）和山羊抗小鼠IgG抗体（1∶100 000），室温孵育后，采用Tanon 5200 Multi全自动化学发光系统观察并拍照。Image J软件分析条带积分吸光度值，目的蛋白积分吸光度值与内参GAPDH积分吸光度值比表示待测蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 SH和CDP联用对顺铂诱导小鼠急性肾损伤血清CRE、BUN和Alb含量及肾组织MDA含量和SOD活性的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清CRE和BUN及肾组织MDA含量显著升高（P＜0.01），血清Alb含量和肾组织SOD活性则明显下降（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组血清CRE、BUN及肾组织MDA 含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），肾组织SOD活性显著升高（P＜0.01）；血清Alb除模型+CDP 25 mg·kg-1组无显著升高外，其余各组均显著升高（P＜0.01）。与模型+SH 50 mg·kg-1相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1联合用药组血清CRE和BUN浓度及肾组织MDA含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），血清 Alb浓度和肾组织SOD活性均显著升高（P＜0.01）。与模型+CDP 25 mg·kg-1组相比，2个联合用药组血清CRE和BUN浓度均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），血清Alb浓度和肾组织SOD活力均显著升高（P＜0.01），模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组肾组织MDA含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1组相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1联合用药组血清CRE和BUN浓度及肾组织MDA含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），肾组织SOD活力均显著升高（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of preventive treatment with sargrelate hydrochloride（SH）and cabidopa（CDP）（alone or in combina⁃tion）on levels of serum creatinine（CRE），blood urea nitrogen（BUN），albumin（Alb）in serum，and malondialde⁃hyde(MDA)content and superoxide dismutase(SOD)activity in renal tissues in cisplatin（CDDP）-induced acute kidney injury(AKI)mice

2.2 SH和CDP联用对顺铂诱导急性肾损伤小鼠肾组织5-HT，DA，ROS，TNF- α和IL-1 β的影响

ELISA检测结果（表2）显示，与正常对照组相比，模型组肾组织5-HT，ROS，TNF-α和IL-1β含量显著升高（P＜0.01），而DA无明显变化。与模型组比较，各给药组DA含量无明显变化，且除模型+CDP 25 mg·kg-1组TNF-α和IL-1β含量无明显降低外，其余给药组TNF-α、IL-1β及各给药组5-HT和ROS含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型+SH 50 mg·kg-1组相比，2个联合用药组肾组织5-HT和TNF-α含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组肾组织ROS和IL-1β含量显著降低（P＜0.01）。与模型+CDP 25 mg·kg-1组相比，2个联合用药组肾组织5-HT，ROS，TNF-α和IL-1β含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。且与模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1组相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组肾组织5-HT（P＜0.05）、ROS、TNF-α和IL-1β均显著降低（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on levels of renal 5-hydroxy⁃tryptamine(5-HT)，dopamine(DA),reactive oxygen speies(ROS)，tumor necrosis factor- α (TNF- α)and interleu⁃kin-1 β (IL-1 β)in CDDP-induced AKI mice

2.3 SH和CDP联用对顺铂诱导急性肾损伤小鼠肾组织病理改变的影响

如图1所示，模型组小鼠肾外观颜色由正常的紫红色变为灰白色；2个联合用药组肾颜色为粉红色，尤以模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组最明显（图1B）。HE染色可见，模型组肾组织病变主要出现在肾小球周围肾小管，而肾小球病变不明显；肾小球周围肾小管大片损伤，表现为上皮细胞大量脱落、坏死、空泡化和管形破坏。各给药组可见肾小管病变减轻，以SH和CDP联合用药组疗效最佳。

Fig.1 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on kidney appearance and renal pathological injury induced by CDDP in AKI mice.See Tab.1 for the mouse treatment.A：representative pictures of kidneys in each group；B：representative pictures of renal tissue sections by hematoxylin and eosin（HE）staining.Typically，the arrows show renal tubules epithelial cells shedding，necrosis or vacuolization in the model.

2.4 SH和CDP联用对顺铂诱导急性肾损伤小鼠肾组织细胞凋亡的影响

如图2所示，Hoechst33342荧光染色细胞凋亡检测表明，与正常对照组比较，模型组细胞凋亡主要出现在肾小管上皮细胞，且以肾小球周围肾小管最明显，可见细胞核的荧光蓝染加深、肾小管上皮细胞脱落和管形破坏、几乎不见完整管形。各给药组均显示细胞凋亡程度减轻，细胞核Hoechst33342荧光亮度减弱，肾小管上皮细胞的破坏减轻，其中模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组肾小管管形完整，上皮细胞未被破坏。

Fig.2 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on apoptosis induced by CDDP in renal tissue detected by Hoechst33342 fluorescent staining.See Tab.1 for the mouse treatment.

2.5 SH和CDP联用对顺铂诱导急性肾损伤小鼠肾组织MAO-A、Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶 3和胱天蛋白酶9蛋白表达水平的影响

Western印迹结果（图3）所示，与正常对照组比较，模型组MAO-A、Bax、胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶 3表达水平显著升高（P＜0.01），而Bcl-2表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，各给药组MAO-A表达明显降低（P＜0.01），且与各组对肾组织ROS含量升高的抑制程度一致（表2）；除模型+CDP 25 mg·kg-1组外，其余各给药组Bax、胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3表达明显降低而Bcl-2表达明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。与模型+SH 50 mg·kg-1组和模型+CDP 25 mg·kg-1组相比，2个联合用药组MAO-A、Bax、活化胱天蛋白酶3表达显著降低，Bcl-2表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组胱天蛋白酶 9表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1组相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组MAO-A的显著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on expression of renal MAO-A，Bax，Bcl-2，cleaved-caspase 3 and caspase 9 in CDDP-induced AKI mice detected by Western blotting.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with model+SH 26.7+CDP 13.3 group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，compared with model+CDP 25 group；◇P＜0.05，◇◇P＜0.01，compared with model+SH 26.7+CDP 13.3 group.

3 讨论

本研究发现，SH和CDP均可有效改善顺铂导致的AKI，并且，SH和CDP联用疗效更为明显。联合给药组的剂量只有SH或CDP单独给药组剂量约1/2，疗效较SH组好或相当，且明显好于CDP组。表明联合给药具有协同效应，且模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1组效果好于模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1组。

顺铂致AKI的发病机制复杂，现有研究认为顺铂引起ROS生成增加，进一步引起细胞氧化应激、炎症和凋亡等［5，19-20］。一方面，ROS大量堆积引起体内发生氧化应激，氧化系统与抗氧化系统失衡。本研究发现，抑制5-HT2AR或5-HT合成后均可显著降低肾组织ROS产生，改善顺铂引起的氧化应激，同时抑制5-HT2AR和5-HT合成（SH联合CDP）疗效最佳。同时发现，抑制5-HT2AR或（和）5-HT合成对顺铂引起MAO-A表达的改变同肾氧化应激水平的改变一致，表明肾氧化应激水平与5-HT在MAO-A作用下的降解过程存在内在联系。另一方面，ROS作为信号转导因子，能够激活其下游的炎症及凋亡信号通路［21-22］，导致炎性细胞因子TNF-α 和IL-1β产生，同时凋亡信号通路激活后导致胱天蛋白酶9和活化胱天蛋白酶3等为终末因子的细胞凋亡应答反应［23］，导致 AKI［24］。本研究发现，SH 及 CDP（单独或联合）预防性治疗可有效抑制顺铂引起的AKI小鼠体内炎症和凋亡。

前期研究表明，2型糖尿病进展过程中，高血糖及高浓度饱和脂肪酸诱导的骨骼肌疲劳、肾损伤，其关键原因是骨骼肌细胞及肾小球系膜细胞的MAO-A表达上调、5-HT降解增多，导致线粒体ROS产生增多［18-19］，其过程还牵涉到5-HT合成及5-HT2AR。其中，5-HT2AR可通过介导MAO-A及5-HT合成酶Tph1、AADC的表达来调控线粒体5-HT降解和ROS产生［16，18］。结合本研究结果推测，顺铂引起肾组织ROS产生增多、导致AKI的原因可能也是如此。具体可能由于AKI引起肾组织5-HT2AR激活和5-HT合成增加，进而引起5-HT降解增加，导致细胞内ROS生成增加。因此，用SH拮抗5-HT2AR和用CDP抑制5-HT合成时，可有效预防顺铂致AKI的发生。总之，通过同时抑制外周5-HT2AR及5-HT合成可有效预防AKI的发生，可为临床治疗AKI提供理论依据和新靶点。