MRPL48在骨肉瘤中的预后及其转移相关性分析

覃文涛，胡阳，谢明净，吉克以吉，薄占东

(广西医科大学第一附属医院骨关节外科，广西 南宁 530022)

0 引言

骨肉瘤(osteosarcoma)是骨骼的主要的恶性肿瘤之一[1,2]，在儿童和青少年阶段常见，其中15-19岁为高发年龄，发病率在每年800-1100万[3]。骨肉瘤具有很强的侵袭性和转移性，发生转移的骨肉瘤患者生存率降低，总体生存率仅为30%[4]。尽管目前术后化疗作为治疗骨肉瘤患者的主要方式之一，但是化疗发生耐药后的转移患者预后极差，5年生存率仅有20%[5]。由于骨肉瘤存在基因异质性，在同样条件下的治疗，患者会有不一样的临床疗效，导致总体预后存在差别[6]。因此深入探索骨肉瘤发生和转移的分子机制，来寻找到特异度高的预后生物学标志，这对于提高骨肉瘤的临床治疗效果将是至关重要的。

线粒体核糖体蛋白L48(Mitochondrial Ribosomal Protein L48，MRPL48)是一种蛋白质编码基因，又称CGI-118，定位于染色体的11q13.4位置上，由核基因编码，有助于线粒体内合成蛋白质。MRPL48可以通过调节细胞线粒体内的代谢过程来维持细胞正常的生理活动[7]，因此MRPL48基因表达的改变将会影响细胞代谢过程，造成疾病的发生。目前已经报道发现，MRPL48在多种肿瘤中存在差异表达，并且在肿瘤的发生和发展过程中有着重要的作用。

本研究拟对开放数据库中大量数据的挖掘，旨在发现MRPL48在骨肉瘤中的预后情况和诊断价值，通过与临床病理特征间的相关性分析，找到临床上更适用于骨肉瘤治疗的靶点。

1 材料与方法

1.1 数据准备

a、人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)检索“MRPL48”基因，了解基因的基本信息；b、在人类蛋白质数据库(Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org/)中分别选用“tissue”和“cell”选项卡，提取MRPL48在各个组织中的表达对比和定位情况；c、在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中检索“Osteosarcoma”，挑选出两个数据集GSE11416和GSE28424，利用在线分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)进行差异分析；d、从加州大学圣克鲁斯分校西纳分校(UCSC Xena，https://xena.ucsc.edu/)中下载骨肉瘤患者的普通转录组数据和临床信息文件，提取MRPL48基因的表达量并筛选出生存资料、性别、年龄和是否转移等临床信息，并对其基因表达量和这些临床信息进行统计分析。

1.2 分析方法

使用Perl软件(版本5.24.3，https://www.perl.org/)对下载的骨肉瘤转录组数据用人类基因组注释文件(ENSEMBL，http://asia.ensembl.org/index.html)进行注释，将Ensembl Gene ID转换为Gene Symbol ID；用R软件(版本3.6.3，https://www.r-project.org/)中的“limma”包对重复基因取均值，最后提取MRPL48基因的表达矩阵和筛选出含有生存资料的临床信息文件。

1.2.2 生存分析

a、以MRPL48表达的中位数作为划分高、低表达组的界限，用R的“survival”包绘制生存曲线，Kaplan-Meir(K-M)法生存分析来鉴定高、低表达组的总体生存率，并进行Log-rank检验进行分析。b、采用单因素Cox回归分析法对MRPL48在骨肉瘤中的预后进行研究。“timeROC”包绘制的受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve，ROC)用来检验MRPL48在骨肉瘤患者1、3、5年的诊断效能。

1.2.3 独立预后分析及临床性状的相关分析

使用R的“survival”包，将MRPL48与性别、年龄和是否转移等临床病理特征进行单因素Cox和多因素Cox回归分析，在多因素Cox的结果中，筛选出P＜0.05的因素作为具有独立预后效应的因子；用R的“ggpubr”包展示MRPL48在各个临床性状间的表达关系，并进行统计学检验。

1.2.4 高、低表达组的差异分析

用R的”limma”包对MRPL48高、低表达的两组进行差异分析，筛选出校正后的P值(FDR)小于0.05和差异倍数对数的绝对值(|logFC|)大于1的值，这些就是高、低表达组的差异基因，并用热图和火山图展示差异基因在高、低两组间表达的差异，用“corrplot”包绘制差异基因之间的相关性图，其中红色表示正相关性，绿色表示负相关性，点的大小代表相关性高低。

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1.2.5 差异基因的功能富集分析

基因本体(gene ontology，GO)和京都基因和基因组百科全书 (kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路的功能富集分析可以用来描述差异基因的功能，R的“clusterProfiler”包可以实现差异基因的功能富集分析[8]，以矫正后的P＜0.05作为显著富集的选择条件。

1.2.6 基因组富集分析(GSEA)

使用GSEAv4.0.3软件(http://www.broadinstitute.org/gsea)对高、低表达组进行GSEA分析，并从分子特征数据库(MSigDB，http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb)下载的c2.all.v7.1.symbols.gmt和c5.all.v7.1.symbols.gmt基因集文件，当P＜0.05、绝对标准化富集得分(NES)≥1和校正后的P值(FDR)＜0.25时被认为时显著富集的基因集。

1.2.7 免疫细胞打分

a、基于单样本基因集富集分析(ssGSEA)的免疫浸润分析 根据各类免疫细胞特征标志性基因的表达，在免疫相关的基因集文件中利用R的“GSVA”包对骨肉瘤的免疫浸润程度进行ssGSEA打分评估。b、利用反卷积的“CIBERSORT”算法估算骨肉瘤每一个患者的22种浸润性免疫细胞的相对含量[9]，这是通过R的“CIBERSORT”包(CIBERSORT的R脚本v1.03，http://cibersort.stanford.edu/)完成。

1.3 统计学方法

所有数据采用R(3.6.2版本)进行统计分析，Kaplan-Meier法用来分析MRPL48表达与骨肉瘤预后的关系，Logrank检验用于评价生存曲线；为了找出预后相关的独立预后因素，将连续性变量(如年龄)转为二分类变量，方法采用单因素Cox和多因素Cox回归分析；皮尔逊相关性分析中，以相关系数(Cor)＞0.2，P＜0.05认为是具有相关性；两组间的数据分析采用双尾t检验，适当的时候用Welcht检验，所有分析均认为P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 MRPL48及其蛋白在正常组织中的表达

HPA数据库中，展示了MRPL48及其蛋白在头、眼、肺和肝脏等16种正常组织中的表达情况，发现MRPL48在头和肌肉组织中的基因表达含量最高，而在肾脏和膀胱中其蛋白表达最多(图1)。并且MRPL48的免疫荧光图显示，其只位于细胞内的线粒体(图2)。

图1 MRPL48及其蛋白在正常组织中的表达情况

图2 MRPL48蛋白主要分布在细胞中的线粒体中

2.2 MRPL48在骨肉瘤细胞中表达

通过GEO2R在线分析工具对 GSE11416和GSE28424进行差异分析发现，MRPL48在各类型骨肉瘤细胞和成骨细胞中表达有显著差异，其中GSE11416(logFC=0.46，P＜0.05)，GSE28424(logFC=0.71，P＜0.05)(表1)。

表1 GEO数据库中骨肉瘤细胞和成骨细胞MRPL48的含量差异情况

2.3 MRPL48在骨肉瘤中的预后关系及效能评价

UCSC数据库中，提取到包含完整临床信息的骨肉瘤患者84例，按照MRPL48表达的中位数将其分成高表达组(n=42)和低表达组(n=42)，Kaplan Meier生存曲线显示，MRPL48的表达水平与骨肉瘤患者生存率具有显著相关性，MRPL48高表达组的生存率明显低于低表达组(图3A)。ROC分析表明，1、3和5年的曲线下面积(AUC)分别为0.831、0.715和0.667，表面MRPL48在骨肉瘤中具有较好的诊断效能(图3B)。

图3 MRPL48的预后及价值评估

2.4 MRPL48与临床性状的联系

单因素和多因素Cox回归分析显示MRPL48的表达和肿瘤是否转移是具有独立预后作用的因素(表2)，MRPL48是危险因素，高表达会降低患者生存率[风险比(HR)=2.30，95%的可信区间(95%CI)：1.02～5.15，P＜0.05]；而非转移成为预后较好的因素，在对转移和非转移的亚组研究时，发现非转移的组别中，MRPL48的表达对预后有显著的影响(HR=0.24，95%CI：0.11～0.54，P＜0.001)(图3C)；而在转移的组别中，对骨肉瘤预后并没有显著的影响(HR=1.19，95%CI：0.45～3.14，P=0.728)(图3D)。此外MRPL48的表达在年龄和是否转移组中有显著差异(图4)。

图4 MRPL48在临床特征值中的表达情况

表2 MRPL48与骨肉瘤患者临床信息间的Cox回归分析结果

2.5 高低表达组差异基因的GO和KEGG功能富集分析

符合|logFC|＞1和P＜0.05的差异基因共有26个，高表达基因5个，低表达的有21个(图5A)；聚类分析显示26个基因在高低组表达有显著的差异(图5B)。GO富集结果显示，差异基因参与了骨骼生长、软骨细胞发育、软骨内骨生长和细胞外结构组成等生物学功能(BP)；在细胞成分(CC)上他们也有参与，如内质网腔、细胞外基质组分和基底膜等；此外他们还参与了分子功能(MF)，包括细胞外基质结构成分、胶原结合和糖胺聚糖结合等(图6A)。KEGG分析表明差异基因主要富集在PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用和蛋白吸收等通路(图6B)。

图5 MRPL48高、低表达组的差异分析结果

图6 差异基因的GO和KEGG功能富集结果

2.6 GSEAGSEA富集结果主要在MRPL48低表达组呈现，其中C2分子集主要富集在肿瘤微环境改善、CD28依赖PI3K AKT信号通路、凝血酶PAR1通路和IL3信号通道等，C5分子集主要在骨细胞发育、软骨细胞分化、破骨细胞分化负调控以及趋化因子合成等通路上(图7)。提示MRPL48低表达组可能在对骨细胞的分化调节上减缓骨肉瘤的发展。

图7 MRPL48低表达组的GSEA富集结果

2.7 免疫浸润分析

通过使用ssGSEA评分算法，我们估算了免疫细胞的30个亚群，在研究MRPL48高、低表达组中免疫细胞的差异性时，发现巨噬细胞和中心粒细胞在高、低表达组中存在明显差异(图8A)，均表现出MRPL48低表达组中高表达，提示巨噬细胞和中心粒细胞在骨肉瘤的预后中起着保护作用。而在“CIBERSORT”算法对骨肉瘤浸润的分析的结果显示，26种免疫细胞中树突状细胞、M2型巨噬细胞和T细胞与MRPL48的表达有一定的相关性(图8B、C、D))，其中树突状细胞(Cor=0.243，P=0.025)和T细胞(Cor=0.292，P=0.007)显示成正相关，M2型巨噬细胞(Cor=-0.244，P=0.024)显示呈负相关性，这与ssGSEA结果一致。

3 讨论

骨肉瘤作为骨科常见的恶性骨肿瘤，其高度侵袭性和转移性是造成患者死亡的主要因素，而骨肉瘤发生转移的机制复杂多样，是多种原因共同影响的结果。目前有研究发现某些基因的表达异常与骨肉瘤的转移有很重要的联系[10]，并根据这些异常表达的基因制定了一些免疫治疗靶点，收到较好的临床效果[11]。因此基因层面对骨肉瘤进行研究，对于治疗骨肉瘤是一个积极有效的途径。

MRPL48是位于细胞内线粒体的关键蛋白，参与线粒体内能量的代谢，维持机体许多重要的生命活动。有研究表明，将ShMRPL48注入Hela细胞内后发现荧光颗粒增加，Hela细胞内线粒体数量下降，细胞生长受到明显的抑制[7]。MRPL48由于维持正常的能量代谢，已被证实其与多种疾病的发生和发展有着十分紧密的联系，不仅在代谢综合征等非肿瘤中有着重要的治疗价值，而且也成为了大肠癌、乳腺癌和肾上腺皮质癌等多种肿瘤的治疗靶点。大肠癌中，MRPL48的高表达可以增加细胞的耐药性，进而影响患者的生存率[12]；肾上腺皮质癌中，MRPL48在良性和恶性肿瘤之间差异也是非常显著[13]。而目前MRPL48尚未在骨肉瘤中报道，本研究通过对网络公开的大量测序数据的分析发现MRPL48与骨肉瘤预后密切相关，提示MRPL48有可能成为骨肉瘤的预后生物标志物。

本研究发现，MRPL48的高、低表达在骨肉瘤患者预后中存在显著差异，MRPL48的高表达组患者总体生存率明显低于低表达组。在两个GEO数据集中，我们验证了MRPL48在骨肉瘤细胞中的表达明显高于正常细胞，提示MRPL48在骨肉瘤病变过程中表达发生了改变。在与骨肉瘤临床性状的研究上，我们发现MRPL48和转移是独立的预后因子，且在对转移与否的亚组研究中发现，MRPL48在转移和非转移的组中的表达差异显著，提示MRPL48可能参与了骨肉瘤的转移发生。鉴于MRPL48高、低表达组预后差异明显，找到两组差异基因，并进行功能富集分析，结果显示差异基因参与了骨骼生长、软骨细胞发育、软骨内骨生长和细胞外结构组成等生物功能，这与GSEA中C5基因集富集结果一致，参与了骨细胞发育和软骨细胞分化分化，这提示MRPL48低表达组预后较好与骨细胞的发育和分化有一定的关系。肿瘤的发生和发展与肿瘤免疫微环境息息相关，而肿瘤微环境中各类免疫细胞的相对含量决定着肿瘤的状态，本研究通过两种不同算法评估了MRPL48与各种免疫细胞的关系，最终发现，两类算法结果均提示M2型巨噬细胞含量与MRPL48的表达成负相关。有研究表明巨噬细胞可以抑制骨肉瘤细胞的转移[14]，而前面研究显示MRPL48在非转移组中的表达显著低于转移组，由免疫浸润分析可知，非转移组的巨噬细胞含量是高于转移组的，因此更加进一步证实我们结论的准确性，MRPL48在骨肉瘤的转移中起到重要的作用。

综上所述，通过生物信息学分析，发现MRPL48在骨肉瘤中具有良好的预后以及评估骨肉瘤转移的价值，可以成为骨肉瘤的潜在治疗靶点。但是由于MRPL48在细胞中的具体作用机制还尚未清晰，有待进一步的实验揭示其分子间的作用方式，提供完整的理论依据，以便完善治疗策略，以期达到临床应用。