Micro R NA-519d-3p对肝星状细胞活化及凋亡的影响

武彦虎，丁向春，王 钊，冯薛烟，汪彭涛，海 龙

（1.宁夏医科大学，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院感染疾病科，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院病原微生物实验室，银川 750004）

肝纤维化主要由慢性病毒性乙型或丙型肝炎、自身免疫性疾病、胆道疾病、酒精性脂肪性肝炎和越来越多的非酒精性脂肪性肝炎引起的一种肝内慢性可逆性损伤修复反应[1]。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生发展的主要效应细胞，HSC的激活与增殖分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成，肝内细胞外基质的过度积累，如果得不到有效治疗，最终可导致严重的肝衰竭及各种终末期肝脏疾病[2]。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过与靶基因miRNA序列3'末端非翻译区（3'UTR）互补配对，阻止其蛋白质翻译而起到转录后抑制作用[3]。miRNA在生长发育、细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤发生等过程中发挥重要作用，研究[4]表明，miRNA通过调控靶基因及其相关信号通路，在HSC活化、肝纤维化相关细胞的调控以及肝纤维化发生发展中都起到了极其重要的作用。miR-519d-3p是一种新发现的具有肿瘤抑制作用的miRNA，近期研究发现，miR-519d-3p在肝星状细胞活化过程中的表达异常，本研究通过体外转染技术，将miR-519d-3p模拟物及其抑制剂转染LX-2细胞（人肝星状细胞系），探讨miR-519d-3p对HSC活化和凋亡的影响，为抗肝纤维化的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM培养基）（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；胰蛋白酶消化液（美国Gibco公司）；细胞全蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒（凯基公司）；异丙醇、甲醇、乙醇、脱脂奶粉（BD公司）；PVDF膜（Milipore Corporation）；SYNERGY2型 酶 标 仪（美国BioTek公司）；实时荧光定量PCR系统（Roche公司）；Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（Invitrogen公司）；RNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］；逆转录试剂盒（Thermo公司）；SYBR染色法实时荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa公司）；引物（Sangon Biotech公司）；miR-519d-3p模拟物、抑制物及阴性对照序列（上海吉玛制药技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将LX-2细胞从-150℃冰箱取出用含10%胎牛血清DMEM培养基（100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素）在10 cm2培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养，换液，传代，取3至6代细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染 将miR-519d-3p模拟物（mimics）、miR-519d-3p模拟物对照物（mimics NC）、miR-519d-3p抑制物（inhibitor）、miR-519d-3p抑制物对照物（inhibitor NC）染LX-2细胞，同时设置未转染的LX-2细胞作为对照组（con）。将LX-2细胞培养至对数生长期，胰酶消化后细胞计数，将HSC-LX2以5×105细胞接种于6孔板内（96孔板每孔细胞数为2×103个），用不含双抗10%胎牛血清的DMEM培养基培养，每孔2 mL。次日，显微镜下观察细胞密度60%～80%后，开始进行转染实验，转染步骤按Lipofectamine RNAi MAX转染试剂和miR-519d-3p合成说明书操作：吸取8μL Lipofectamine RNAi MAX，8μL化学合成的miR-519d-3p，分别加入含150μL opti-MEM的1.5 mL eppendorf管中，然后将二者混合，室温静置5 min，分别加入6孔板对应孔中，每孔250μL（96孔板每孔10μL），置于37℃、5%CO2培养箱中培养1～3 d，分析转染效率。

1.2.3 Real-time PCR检测LX-2细胞miR-519d-3p相对表达量及α-SMA I和Collagen ImRNA表达水平 将细胞按1.2.2方法处理，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录试剂盒提取cDNA、SYBR荧光定量PCR试剂盒进行操作及分析。转染及Real-time PCR所用序列如表1所示，实验结果采用2-ΔΔCt法计算α-SMA及Collagen ImRNA的相对表达量。

表1 转染所用miRNAs及Real-time PCR所用序列

1.2.4 Western blot检测LX-2细胞α-SMA和CollagenⅠ的蛋白表达 按1.2.2方法将LX-2细胞种植在6孔板进行细胞转染，48 h后，提取细胞总蛋白，测蛋白浓度，煮蛋白，以40μg/20μL对蛋白样品进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，转膜1.5 h，封闭1 h，一抗孵育过夜12 h，用TBST溶液洗涤一抗5 min，重复5次，二抗孵育1 h，用TBST溶液洗涤二抗5 min，重复5次，imaging system显影。本实验平行重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测miR-519d-3p对LX-2细胞凋亡的影响 按1.2.2方法将LX-2细胞种植在6孔板进行细胞转染，48 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤细胞二次（2000 r·min-1离心5 min）收集细胞，在50μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液，混匀；收集细胞中加入上述7-AAD染液，混匀；室温避光反应10 min；反应后再加入450μL的Binding Buffer混匀；加入1μL Annexin V-PE混匀；室温避光反应10 min；用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染LX-2细胞后miR-519d-3p的表达

利用Real-time PCR检测各组LX-2细胞中miR-519d-3p相对表达水平。miR-519d-3p mimics组的miR-519d-3p相对表达量高于con与mimics NC组（P均＜0.01）；miR-519d-3p inhibitor组的miR-519d-3p相对表达量低于con与inhibitor NC组（P均＜0.01），见图1。

图1 转染miR-519d-3p mimics与inhibitor的LX-2细胞中miR-519d-3p的相对表达水平比较

2.2 miR-519d-3p对LX-2细胞活化的影响

Real-time PCR检测转染的LX-2细胞中活化标志物α-SMA和Collagen I mRNA表达水平变化。结果显示，与mimics NC组相比，过表达miR-519d-3p能抑制α-SMA和Col lagen ImRNA表达，有抑制肝星状细胞激活的作用（P均＜0.01）；与inhibitor NC组相比，下调miR-519d-3p促进α-SMA和Collagen ImRNA表达，有促进肝星状细胞激活的作用（P均＜0.01），见图2、图3。

图2 Real-time PCR检测转染的LX-2细胞中Collagen I mRNA表达水平比较

图3 Real-time PCR检测转染的LX-2细胞中α-SMA mRNA表达水平比较

2.3 Western blot检测转染的LX-2细胞中α-SMA和CollagenⅠ蛋白水平变化

结果显示，与mimics NC组相比，过表达miR-519d-3p可以抑制α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达，具有抑制肝星状细胞激活的作用（P均＜0.01）；与inhibitor NC组相比，下调miR-519d-3p促进α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达，具有促进肝星状细胞激活的作用（P均＜0.01），见图4。

2.4 miR-519d-3p对LX-2细胞凋亡的影响

miR-519d-3p mimics和inhibitor转染LX-2细胞48 h后，采用AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡试剂盒进行凋亡检测结果显示，与mimics NC组相比，miR-519d-3p mimics组可以促进LX-2细胞的凋亡（P均＜0.01）；与inhibitor NC组相比，miR-519d-3p inhibitor组可以抑制LX-2细胞的凋亡（P均＜0.01），见图5。

3 讨论

图4 Western blot检测转染的LX-2细胞中活化标志物CollagenⅠ和α-SMA蛋白表达水平情况

图5 流式细胞仪检测miR-519d-3p对LX-2细胞凋亡的影响

miRNA是一种与肝纤维化发生发展有密切关系的微小RNA。研究表明，越来越多的miRNA被发现在肝纤维化或者HSC活化过程中异常表达，如miR-134、miR-335、miR-126在肝纤维化的过程中表达下调，具有抑制HSC的激活或者增殖作用；miR-10a、miR-34、miR-21在肝纤维化的过程中表达上调，具有促进HSC的激活或增殖作用。据文献[5]报道，miR-519d-3p在多种肿瘤的发生发展中起着重要作用，在胰腺癌中，核糖体蛋白S15A（RPS15A）是一种各种人类癌症的新型致癌基因，RPS15A表达在胰腺癌细胞系中显著上调，RPS15A被鉴定为miR-519d-3p的靶基因，过表达miR-519d-3p通过抑制RPS15A介导的Wnt/β-连环蛋白信号传导来抑制胰腺癌细胞的生长；在前列腺肿瘤中，miR-519d-3p在前列腺癌细胞中低表达，过表达miR-519d-3p通过降低DU-145前列腺癌细胞肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）水平抑制其增殖[6]；在结直肠肿瘤中miR-519d-3p通过靶向营养素相关蛋白（TROAP）在结直肠癌中抑制细胞增殖和迁移[7]；在宫颈癌中，miR-519d-3p靶向缺氧诱导因子（HIF-2α）抑制宫颈癌细胞增殖和促进细胞凋亡[8]；在乳腺肿瘤中，miR-519d-3p通过靶向LIM域激酶1抑制乳腺癌细胞的生长和运动[9]。在滋养细胞中，miR-519d-3p通过靶向MMP-2抑制滋养细胞的迁移和侵袭[10]；在胃癌中，MiR-519d-3p通过下调B细胞淋巴瘤6（bcl6）抑制胃癌细胞增殖和侵袭[11]。然而，miR-519d-3p对肝星状胞的生物学功能及作用机制的研究还未见国内外报道。肝纤维化是各种终末期肝脏疾病必经阶段，其主要病理改变是细胞外基质的合成和降解失衡，从而引起细胞外基质的大量堆积，最终导致肝纤维化；HSC是肝纤维发生发展的中心环节，是细胞外基质的主要来源细胞，当肝脏受到各种原因引起刺激时，HSC将由静息状态激活并大量增殖，从而导致细胞外基质增加。另外，α-SMA和CollagenⅠ是细胞外基质的主要成分，因此，检测LX-2细胞活化标志物α-SMA和CollagenⅠ含量变化，可以间接反应肝纤维化的逆转情况。本实验通过体外转染miR-519d-3p的模拟物和抑制剂来研究miRNA对HSC株LX-2活化和凋亡的影响。研究表明:miR-519d-3p mimics和inhibitor分别转染LX-2细胞后，Real-time PCR和Western Blot结果显示，转染miR-519d-3p mimics组α-SMA和CollagenⅠmRNA和蛋白表达降低，转染inhibitor组α-SMA和CollagenⅠmRNA和蛋白水平表达增加。另一方面，将miR-519d-3p mimics转染LX-2细胞后，可以促进细胞凋亡，而将miR-519d-3p inhibitor转染LX-2细胞后，可以抑制细胞的凋亡。综上所述，miR-519d-3p在HSC活化过程中具有抑制作用，可以促进HSC的凋亡，抑制肝纤维化的进展，为肝纤维化的治疗指明了新的方向。