Ang1-7通过抑制内质网应激减轻高血压大鼠心肌肥厚

戴亚东，丁奕瑶，马全萍，燕 茹，于 欣，杨 震

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏海原县人民医院心内科，海原 755200；3.宁夏医科大学总医院心脏中心实验室，银川 750004；4.宁夏医科大学总医院心脏中心，银川 750004）

长期高血压会引起左心室心肌肥厚，最终导致心室功能的下降甚至心衰[1]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin angiotensin-aldosterone system，RAAS）是机体内调节血压和水电解质平衡的重要系统，ACE2-Ang1-7-Mas轴是一条与经典升压通路ACE-AngⅡ-AT1相互对抗的RAAS系统新旁路。Ferreira等[2]研究发现，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和AT1受体（AT1R）拮抗剂的药理学效应可能与Ang（1-7）相同。有研究发现[3-4]，ACEI可以通过阻滞AngⅡ的产生而降低血压及逆转心肌肥厚，并可通过抗氧化应激和内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）保护心肌细胞。研究[5-6]证实ERS引起的心肌细胞凋亡可能在心肌肥厚、心力衰竭和心肌梗死中发挥重要作用。但血管紧张素1-7（angiotensin1-7，Ang1-7）能否通过抑制ERS减轻心肌肥厚这一机制尚有待证实，因此本研究采用自发性高血压大鼠模型，观察Ang1-7对自发性高血压大鼠（spontaneous hypertension rat，SHR）血压、左室肥厚及心肌细胞ERS相关因子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和C/EBP同源蛋白质（CHOP）表达的影响，探讨其与心肌肥厚的关系，为Ang1-7防治心血管疾病提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ang1-7（5 mL/支，美国Med ChemExpress公司）；Alzet微型渗透压泵（2 mL，美国Alzet公司）；兔抗大鼠GRP78抗体和兔抗大鼠CHOP抗体（Gene Tex公司）；无创鼠尾动脉血压仪（上海卡尔文公司）；小动物超声成像系统（Vevo2100，富士VisualSonics公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 实验动物与分组处理

实验所用的SHR和Wistar-kyoto（WKY）大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证书：SCXK（京）2016-0006，WKY大鼠是SHR常用的血压正常的对照组品系。所有的大鼠均饲养在宁夏医科大学实验动物中心标准的SPF级的屏障系统里，采用普通大鼠饲料饲养。所有实验动物处理符合实验守则和宁夏医科大学实验动物福利与伦理委员（IACUC）的要求，所有手术于麻醉状态下进行。

购买16周龄WKY大鼠5只和SHR 15只，分别测量收缩压（systolic blood pressure，SBP）及舒张压（diastolic blood pressure，DBP）。选择SBP＞140 mmHg，DBP＞90 mmHg的SHR 10只，随机分为药物干预组（Ang1-7+SHR，AS）和安慰剂对照组（normal+SHR，NS），WKY大鼠作正常对照组（normal control，NC），共3组。AS组按400 ng·（kg·min）-1的剂量皮下Alzet微渗泵连续注射Ang1-7，持续给药4周；NS组按相同容积泵速皮下微渗泵注射0.9%NaCl，持续给药4周；NC组不做任何处理。于干预结束后测量3组大鼠血压，行超声心动图检查后处死全部大鼠并留取心脏标本。

1.3 指标检测

1.3.1 各组大鼠血压值的测量 使用卡尔文鼠尾动脉血压仪尾套法测量各组大鼠干预前16周龄和干预后20周龄时的血压水平。每只大鼠测量3次取血压平均值，每次测量间隔10 min以上，分别记录SBP及DBP。

1.3.2 超声心动图检查 药物干预4周后，使用小动物超声成像系统检测大鼠心脏肥厚程度和功能。检查时将大鼠麻醉，四肢固定在手术台上，在胸部左侧放置探针进行M型成像测量并记录；连续采样至少5个心动周期，重复采样3次。测量参数包括舒张期后壁厚度（diastolic posterior wall，PWd）、收缩期后壁厚度（systolic posterior wall，PWs）和舒张期室间隔厚度（diastolic interventricular septum，IVSd）、收缩期室间隔厚度（systolic interventricular septum，IVSs）、左心室质量（left ventricular mass，LVM）以及左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening）。LVM依照公式计算：LVM=1.04×［（LVEDd+PWd+IVSd）3-LVEDd3］。功能参数短轴缩短率（FS）按公式计算：FS=100%×（LVEDd-LVEDs）/LVEDd。［LVEd为左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter）；LVEDs为左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter］。

1.3.3 苏木精-伊红（HE）染色观察心肌细胞形态 大鼠经异氟烷吸入麻醉后沿剑突开胸取其心脏，置于培养皿中，生理盐水洗涤3次后用多聚甲醛固定，脱水后行石蜡包埋，将心脏组织石蜡块切片，厚度5μm，备用。切片经脱蜡、水化后，苏木素浸染3 min，水洗5 min，1%的盐酸乙醇分化5 s，水洗，0.5%伊红染2 min，流水快速冲洗、脱水、透明、封片固定，光镜下观察心肌细胞形态。

1.3.4 Masson染色观察心肌细胞胶原纤维 心脏组织石蜡切片经脱蜡、水化后，苏木素染色6 min，自来水冲洗至变蓝色，盐酸乙醇分化5 s，水洗，丽春红品红溶液染6 min，蒸馏水冲洗，磷钼酸溶液、苯胺蓝分别染5 min，乙醇处理1 min，脱水、透明后，中性树胶封片，每个切片在400倍光学显微镜下观察心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色，并随机选取3个视野拍照。

1.3.5 免疫组化检测各组大鼠心肌组织中GRP78及CHOP蛋白的表达 将心肌组织的石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，用柠檬酸盐洗冲液在高温高压连续喷气5 min进行抗原修复，待自然冷却后PBS洗涤3次，各3 min，擦干后3%H2O2室温下封闭20 min，室温下山羊血清封闭30 min，滴加1∶300稀释兔抗大鼠GRP78一抗孵育（4℃过夜）。复温30 min后PBS洗涤，加一滴聚合物增强剂（室温孵育20 min），滴加1∶500稀释羊抗兔IgG（室温孵育20 min），滴加新鲜DAB显色，复染、脱水、透明、中性树胶封片，镜下观察结果，测定平均光密度（AOD）值，并进行定量分析。CHOP兔抗大鼠一抗兔二抗稀释比例及测定步骤同GRP78。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两样本t检验，干预前后比较采用配对t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang1-7对大鼠血压的影响

大鼠干预前16周龄时，NS组、AS组大鼠SBP和DBP均高于NC组（P均＜0.01）。药物干预后20周龄时，NS、AS组大鼠的SBP及DBP均高于NC组（P均＜0.01）；AS组SBP与DBP水平均低于NS组（P均＜0.01）。NS组大鼠20周龄时SBP与DBP水平与16周龄时差异均无统计学意义（P均＞0.05）；AS组大鼠20周龄时SBP、DBP均低于16周龄时（P均＜0.01），见表1。

表1 3组大鼠血压的比较（±s，mmHg）

表1 3组大鼠血压的比较（±s，mmHg）

与16周龄相比*P＜0.01；与NC组相比#P＜0.01；与NS组相比▲P＜0.01。

?

2.2 Ang1-7对大鼠心肌肥厚和左室功能的影响

图1为药物干预4周后行超声心动图检查获取的M型图像。干预后，NS组大鼠PWd、PWs、IVSd、IVSs及LVM均高于NC组（P均＜0.05）；AS组大鼠PWd、PWs、IVSd、IVSs及LVM均低于NS组（P均＜0.05）。而FS各组大鼠间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图1 左心室的M型超声图像

表2 4周后3组大鼠左心室超声心动图检测指标比较（±s）

表2 4周后3组大鼠左心室超声心动图检测指标比较（±s）

与NC组相比*P＜0.05；与NS组相比#P＜0.05。

?

2.3 Ang1-7对大鼠心肌细胞形态学的影响

HE染色显示，NS组心肌细胞较NC组心肌细胞明显肥大，给予Ang1-7干预后，AS组的心肌细胞较NS组明显纤细，较为接近NC组，见图2。

图2 各组大鼠心肌细胞形态学的变化（HE×400）

2.4 Ang1-7对大鼠心肌组织胶原纤维的影响

NC组大鼠心肌细胞（呈红色）形态规则，间质轻微纤维化（呈蓝色）；NS组大鼠心肌排列紊乱，发生明显纤维化；给予Ang1-7干预后，AS组大鼠心肌组织排列规则，相比NS模型组胶原纤维分布减少，见图3。

图3 各组大鼠心肌细胞胶原纤维的比较（Masson染色×400）

2.5 Ang1-7对大鼠心肌细胞GRP78和CHOP蛋白表达的影响

NS组大鼠心肌细胞GRP78和CHOP的表达主要定位于心肌细胞胞质中，染色呈棕黄色，见图4；NS组心肌细胞GRP78、CHOP蛋白均较NC组增多（P均＜0.01）；与NS组比较，AS组心肌细胞中GRP78和CHOP相对蛋白表达量均减少（P均＜0.01），见表3。

图4 各组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP蛋白的表达（免疫组化×400；↑：胞质中GRP78和CHOP蛋白高表达）

表3 Ang1-7对大鼠心肌细胞GRP78和CHOP蛋白表达的影响（±s）

表3 Ang1-7对大鼠心肌细胞GRP78和CHOP蛋白表达的影响（±s）

与NC组相比*P＜0.01；与NS组相比#P＜0.05。

?

3 讨论

心脏对压力负荷非常敏感，长期高血压可致左心室肥厚和重构。SHR是具有自发性发生高血压特征的大鼠，被广泛选择作为人类心肌肥厚研究的理想动物模型[7]。本研究结果显示，Ang1-7干预组的SHR血压水平及室间隔厚度、左心室质量等指标均低于未干预组，提示Ang1-7干预可降低自发性高血压大鼠血压，减轻压力负荷并在一定程度上逆转左室肥厚。Ang1-7有多条降压途径，其中通过ACE2/Ang1-7拮抗AngⅡ的作用最为重要。Kuczeriszka等[8]研究表明，通过AngⅡ灌注建立的高血压模型中，Ang1-7缺失导致水钠潴留增加，血压升高，而Ang1-7能够通过血管紧张素受体1（AT1）介导纠正AngⅡ的上述作用，阻止血压升高。

本文同时观察了SHR心肌细胞内质网应激相关因子GRP78、CHOP的表达及Ang1-7对它们的影响，以探讨其与心肌肥厚的关系。结果显示高血压大鼠ERS信号分子GRP78和CHOP的表达均增加，经Ang1-7干预后，两因子在心肌组织的表达显著降低，GRP78表达的上调是迄今为止公认的ERS激活的标志[9]，而CHOP是ERS凋亡的标志[10]，表明SHR所致的肥厚心肌存在内质网应激，且Ang1-7可以抑制上述改变，从而对心肌组织起到有效的保护作用，使心肌组织受损程度降低。该作用可能是通过减轻内质网应激、改善内质网的稳态从而起到逆转心肌肥厚的作用，推测这可能是Ang1-7减轻心肌肥厚的一个机制，这与周玉荣等[11]研究结果一致。也有研究表明[12]，AT1受体（AT1R）拮抗剂-缬沙坦通过特异性阻断AngⅡ与AT1受体的结合，消除AngⅡ对血压和心功能的影响，抑制SHR心肌细胞ERS激活，减轻心肌细胞凋亡而发挥心脏保护作用。提示Ang1-7通过抑制SHR心肌细胞ERS减轻心肌肥厚所致的心肌损伤。

综上所述，Ang1-7能显著降低SHR血压水平，并可通过抑制ERS减弱左心室肥厚，使肥厚心肌细胞受损程度有所减轻并好转。Ang1-7因对心血管具有良好的保护作用目前已经获得广泛关注，本文从分子水平上讨论了该药物对心肌组织的可能保护途径，为心肌肥厚的研究提供了新的思路。