lnc R NA DI N O在同型半胱氨酸致内皮细胞凋亡中的作用

刘 圆，张 辉，马胜超，李桂忠，姜怡邓

（宁夏医科大学基础医学院，宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，国家卫健委代谢性心血管疾病研究重点实验室，银川 750004）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）[1]是一种发生于大中型动脉的慢性疾病，是各类缺血性心脑血管疾病的病理学基础，其发生机制复杂，目前存在多种假说，内皮细胞功能障碍作为As发病的初始和必要步骤获得大多数学者认可。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是体内蛋氨酸代谢过程中形成的一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸循环的中间产物[2]。本课题组前期研究[3]表明，Hcy可导致内皮细胞凋亡，但其具体机制尚不明确。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）[4]是一类长度超过200 nt，无编码能力的转录产物。lncRNA可以在表观遗传修饰水平、转录水平和转录后水平等多个层次调控基因表达[5-6]，从而在细胞分化、增殖、凋亡、迁移和多能干细胞再生等多个生理过程中起到重要作用。lncRNA DINO作为lncRNA的一员，在癌细胞的迁移、凋亡[7]中发挥重要作用，但其在Hcy致内皮细胞凋亡中的作用尚不明确。本文旨在明确lncRNA DINO在Hcy诱导内皮细胞凋亡中的作用，为As的治疗提供理论基础及实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）（中国，名劲生物技术有限公司）；Hcy（美国，Sigma公司）；胎牛血清、DMEM培养基（澳大利亚，Gibco公司）；青链霉素、胰蛋白酶消化液、NP-40（中国，碧云天生物技术研究所）；细胞活力荧光测定试剂盒（瑞士，Roche公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂（中国，北京索莱宝科技有限公司）；Bax抗体、Bcl-2抗体（英国，Abcam公司）；β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗（中国，北京金桥有限公司）；脱脂奶粉（美国，BD公司）；cDNA试剂盒、RTqPCR试剂盒（日本，Takara公司）；Lipo2000（美国，Thermo Fisher公司）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（上海，Best bio公司）；引物由上海生工有限公司合成；lncRNA DINOsiRNA、si-NC由湖州河马科技有限公司构建。

1.2 仪器与设备

超净工作台（苏州，安泰）；CO2培养箱（德国，Heraeus公司）；5415D型微量台式离心机（德国，Eppendorf公司）；超微量分光光度计（美国，SimpliNano公司）；垂直电泳仪、转膜仪、曝光仪（美国，Bio-Rad公司）；BS110S型精密天平（德国，Sartorius公司）；水平摇床（美国，Thermo Fisher公司）；梯度RCR仪（德国，Biometra Tone公司）；荧光定量PCR仪（上海，枫岭）；ACEA NovoCyte流式细胞仪（美国，艾森）；激光共聚焦显微镜（德国，ZEISS）。

1.3 方法

1.3.1 HUVECs细胞培养 用含10%胎牛血清DMEM培养基培养HUVECs，置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞密度达70%左右时，用终浓度0μmol·L-1Hcy（对照组）、100μmol·L-1Hcy（实验组）干预细胞72 h后，收集细胞用于后续实验。

1.3.2 MTT法检测Hcy作用于HUVECs细胞的最适浓度 将HUVECs细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24 h弃上清，将含不同浓度Hcy（0、50、100、200和500μmol·L-1）的细胞培养液按照100μL/孔加入培养板中，每个浓度设置3个复孔，37℃、5%CO2培养72 h后，MTT法测细胞存活率（按照说明书操作）。

1.3.3 细胞活力染色检测HUVECs细胞凋亡情况 弃去培养基，将激光共聚焦皿中的细胞用PBS清洗3次，在15 mL离心管中加入5 mL PBS，5μL Nuclei Dye、25μL Dead Dye、3μL Viable Dye，将3种染料混合后，在每个培养皿中依次加入200μL混合染料，于37℃孵育30 min后取出，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。

1.3.4 流式细胞术检测HUVECs细胞凋亡情况 使用不含EDTA、不含酚红的胰酶消化内皮细胞，800 r·min-1、4℃离心10 min弃上清。冷PBS洗涤细胞3次后，用800μL 1×Annexin V结合液重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC染色液，混匀，4℃避光孵育15 min，加入5μL PI染色液后混匀，避光孵育5 min，立即置于流式细胞仪检测细胞凋亡改变。

1.3.5 RT-qPCR检测各组HUVECs细胞中lncRNA DINO表达 按Takara RNA试剂盒的说明书操作提取各组细胞总RNA并进行逆转录。PCR扩增程序：95℃30 s；95℃5 s；60℃34 s，共40个循环，并设内参（GADPH）对照同体系扩增。目的基因的相对量以2-△△Ct表示。引物序列见表1。

表1 lncRNA DINO及GAPDH的引物序列

1.3.6 lncRNA DINO干扰片段转染HUVECs细胞 将HUVECs细胞接种于6孔板中培养24 h，细胞密度达70%，严格按照Lipofectamine 2000试剂盒操作说明书进行转染操作，分别将5μL阴性对照si-NC和si-DINO加入250μL无血清培养基，轻柔混匀，将6μL Lipofectamine TM2000脂质体与250μL无血清培养基混匀，室温放置5 min。5 min后，两者混匀，室温放置20 min。6孔板中每孔用不含血清的培养基定容至2 mL，放入恒温培养箱继续培养，转染6 h后对照组更换7%DMEN培养基，实验组更换含100μmoL·L-1Hcy的培养基继续培养72 h。

1.3.7 Western blot测定HUVECs中Bax、Bcl-2蛋白表达 PMSF与NP-40裂解液按1∶100配制蛋白裂解液，依据细胞量加入裂解液，置于摇床，4℃，30 min后，12000 r·min-1、4℃离心20 min，转移蛋白上清液至新的EP管中，按照蛋白与缓冲液4∶1的比例，加入上样缓冲液，99℃煮沸变性5 min。每孔300μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳，将胶转印至0.22μm PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，PBST洗膜10 min，共3次，分别加入β-actin抗体（1∶10000）、Bax、Bcl-2抗体（1∶2000），4℃过夜，PBST室温洗膜10 min，重复3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5000）室温孵育2 h后，PBST室温洗膜10 min，重复3次，曝光。以Bax、Bcl-2与β-actin的光密度值比值作为Bax、Bcl-2蛋白表达的相对量。

1.4 统计学方法

本研究实验数据均为计量资料，采用Prism 7.0统计软件对数据进行分析，结果以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，多样本均数间比较采用one-way ANOVA检验，组间两两比较用SNK-q检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测Hcy作用于HUVECs细胞的最适浓度

MTT法检测不同浓度0、50、100、200和500 μmol·L-1Hcy对内皮细胞存活率的影响，结果显示：随着Hcy浓度的增加，内皮细胞存活率逐渐降低，呈现剂量依赖关系，100、200和500μmol·L-1内皮细胞存活率均下降（P均＜0.001），50μmol·L-1Hcy内皮细胞存活率相较于对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 MTT法检测Hcy作用于HUVECs细胞的最适浓度

2.2 细胞活力染色检测Hcy对HUVECs细胞凋亡的影响

细胞活力染色检测Hcy对内皮细胞凋亡的影响，用激光共聚焦显微镜观察，结果显示：与对照组相比，实验组凋亡细胞数（红色细胞数）增加，细胞活力降低，见图2。

图2 HUVECs细胞凋亡情况（细胞活力染色×100）

2.3 流式细胞术检测Hcy对HUVECs细胞凋亡的影响

流式细胞术分析Hcy干预后内皮细胞凋亡水平变化，结果显示：与对照组相比，实验组内皮细胞凋亡水平增加（P＜0.01），见图3。

图3 流式细胞术检测Hcy对HUVECs细胞凋亡的影响

2.4 RT-qPCR检测Hcy对HUVECs细胞lncRNA DINO表达的影响

RT-qPCR检测HUVECs细胞lncRNA DINO的表达，结果显示：与对照组相比，实验组lncRNA DINO表达增加（P＜0.01），见图4。

图4 RT-qPCR检测Hcy对HUVECs细胞lncRNA DINO表达的影响

2.5 RT-qPCR检测转染lncRNA DINO干扰片段后HUVECs细胞的lncRNA DINO表达

转染si-DINO后，RT-qPCR检测HUVECs细胞的lncRNA DINO表达，结果显示：与si-NC组相比，si-DINO组的lncRNA DINO表达降低（P＜0.01），见图5。

图5 RT-qPCR检测转染lncRNA DINO干扰片段后HUVECs细胞的lncRNA DINO表达

2.6 细胞活力染色检测Hcy对转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs的细胞凋亡的影响

为进一步明确lncRNA DINO对内皮细胞凋亡的影响，细胞活力染色检测Hcy作用于转染si-DINO后的HUVECs细胞凋亡情况，结果显示：Hcy干预后，与Hcy-NC组相比，Hcy-si组红色细胞数目明显减少，见图6。

图6 Hcy对转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs细胞凋亡的影响（细胞活力染色×100）

2.7 流式细胞术检测Hcy对转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs细胞凋亡的影响

流式细胞术检测Hcy作用于转染si-DINO后的HUVECs的细胞凋亡水平，结果显示：Hcy干预后，与Hcy-NC组相比，Hcy-si组内皮细胞凋亡水平下降（P＜0.01），见图7。

2.8 Western blot检测Hcy对转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs的细胞Bax、Bcl-2的表达

Western blot检测Hcy作用于转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs的细胞Bax、Bcl-2表达，结果显示：Hcy干预后，与Hcy-NC组相比，Hcy-si组中Bax、Bcl-2表达下降（P＜0.01），见图8。

3 讨论

图7 Hcy对转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs细胞凋亡的影响

图8 Hcy对转染lncRNA DINO干扰片段的HUVECs的细胞Bax、Bcl-2表达

As是一种以内皮细胞凋亡、平滑肌细胞增殖、泡沫细胞形成为主要特征的慢性进行性疾病，是造成世界范围内心脑血管疾病高发病率和病死率的主要原因[8]。在As的发病机制中，内皮细胞功能障碍作为始动环节起着至关重要的作用[9]。在引起内皮功能障碍的诸多因素中，内皮细胞凋亡受到了广泛关注[10-11]。Hcy是体内蛋氨酸代谢循环中形成的一种含硫氨基酸，各种临床实验及流行病学研究表明，其是心血管疾病的独立危险因子[12]。研究[13-14]发现，高同型半胱氨酸可下调Bcl-2 mRNA及蛋白的表达，促进内皮细胞凋亡，加速As的发生发展，增加叶酸和VB12可减少高同型半胱氨酸所致的细胞凋亡。本实验中通过MTT法检测Hcy对内皮细胞存活率的影响，选择最适浓度为100μmol·L-1，干预细胞后，细胞活力染色及流式细胞术检测发现凋亡细胞数增加，进一步证实了Hcy对内皮细胞的凋亡作用，但对Hcy诱导的内皮细胞凋亡的具体机制尚不明确。

lncRNA作为一种长度大于200个核苷酸的RNA分子[15-16]，可分为正义型、反义型、双向型、内含子区和基因间5大类[17]。lncRNA不编码蛋白质，缺乏开放阅读框，曾被误以为是RNA界的“噪音”，不具有生物学功能。但近来研究发现，lncRNA是一类新兴的基因表达调控子，其参与基因的表观调控、转录调控以及转录后调控等，从而在多种生物学过程中如细胞的增长[18]、细胞周期的调控[19]、凋亡[20]、迁移、侵袭和转移等发挥关键的作用。lncRNA DINO是新近发现的一种新型lncRNA，其广泛参与癌症发展机制，有文献报道lncRNA DINO通过重新激活抑癌基因TP53的表达抑制宫颈癌的转移[21]；也有文献报道其可抑制胃癌细胞的凋亡率，在胃癌进展中发挥抑瘤作用[22]，但在Hcy诱导的内皮细胞凋亡中的作用暂无报道。本研究发现Hcy干预内皮细胞lncRNA DINO表达增加，为进一步明确其作用，转染lncRNA DINO干扰片段后，细胞活力染色和流式细胞术检测显示，si-DINO组细胞凋亡数较si-NC组凋亡数明显减少，且Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达下降，提示lncRNA DINO能够促进Hcy诱导的内皮细胞凋亡。

综上所述，我们以HUVECs的凋亡为研究切入点，旨在探讨lncRNA DINO在Hcy诱导的内皮细胞凋亡中的作用。实验结果表明，lncRNA DINO能够促进Hcy诱导的内皮细胞凋亡。因此，继续深入探讨lncRNA DINO在Hcy诱导的HUVECs凋亡调控机制，将有望为As的防治寻找新的靶点。