Nesfatin-1对高糖诱导足细胞损伤的保护作用

胡亚楠，李 健，胡振兴，吴海峰，何 瑞，李广永，李培军

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院泌尿外科，银川 750004；3.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，银川 750004）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的一种常见并发症。DN患者通常表现为滤过率降低、蛋白尿，最终导致肾功能衰竭。足细胞作为肾小球滤过膜的关键结构之一，有着重要的屏障作用，可以有效阻止血浆蛋白的泄漏。足细胞损伤是DN进展的一个关键因素，足细胞再生能力有限，因此足细胞损伤的程度通常被视为影响DN预后的重要因素。既往研究表明[1]，足细胞损伤是DN患者导致肾小球疾病的重要早期事件。现有的抗高血糖治疗方法未能有效治疗DN，因此，开发新的DN治疗方法有助于改善DN患者的结局。Nesfatin-1由胃黏膜中的X/A样细胞分泌，分别通过下丘脑起刺激和抑制食物摄入的作用。课题组前期研究发现Nesfatin-1对糖尿病及其并发症有明显改善作用[2]，但Nesfatin-1对高糖诱导足细胞损伤的保护作用尚未有研究报道。因此本研究利用高糖诱导肾脏足细胞，模拟DN的足细胞病变，给予Nesfatin-1干预，探索Nesfatin-1对高糖诱导足细胞损伤的保护作用，旨在为临床治疗DN提供新的治疗思路及方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

二氧化碳培养箱（利康生物医疗科技控股有限公司），低温离心机（Eppendorf公司），全波长酶标仪（Thermo Fisher公司），倒置显微镜（OLYMPUS公司），SDS-PAGE电泳仪设备（Bio-Rad公司）。

1.2 细胞系

永生化小鼠足细胞系（MPC-5）（北京北纳创联生物技术研究所）。

1.3 试剂及抗体

DMEM普通和高糖培养基［赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司］；BCA试剂盒及SDS-PAGE凝胶配置试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；细胞冻存液和CCK-8试剂盒（南京建成生物工程研究所）；胰蛋白酶和新生小牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；DMSO（纯度99.5%，无锡市亚泰联合化工有限公司）；Nephrin和β-actin单克隆抗体（abcam公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Western blot ECL（上海雅酶生物科技有限公司）。

1.4 溶液配制

（1）完全培养基配制：5 mL胎牛血清、45 mL DMEM普通培养基和500μL双抗混匀；（2）高糖培养基配制：5 mL胎牛血清、45 mL DMEM高糖培养基和500μL双抗混匀；（3）含Nesfatin-1的溶液配制：取10-8M的Nesfatin-1 12.5μL加入50 mL的高糖培养基混匀。

1.5 方法

1.5.1 MPC-5细胞培养和处理 MPC-5细胞在含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基（5.6 mmol·L-1葡萄糖）中培养，温度为37℃，含5%CO2。将MPC-5细胞接种于96孔板和6孔板中，用于后续实验。分组：对照组（5.6 mmol·L-1葡萄糖）、高糖组（25 mmol·L-1葡萄糖）、治疗组（25 mmol·L-1葡萄糖+10-8M Nesfatin-1）[3]。造模前去血清饥饿足细胞16 h，高糖培养基培养MPC-5细胞24 h，后加入Nesfatin-1进行治疗。由于Nesfatin-1的半衰期很短（9～10 min），因此作用时间选择1 h[3]。

1.5.2 倒置显微镜观察MPC-5细胞形态、CCK-8法检测其存活率 将MPC-5细胞以2000个/孔的密度接种于96孔板中贴壁8 h，饥饿16 h，高糖培养基处理24 h后在100倍显微镜下进行观察并拍图，然后加入Nesfatin-1处理1 h后再次进行显微镜下观察及拍图。加入CCK-8试剂盒检测细胞活性。在450 nm波长处测定吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=［（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）］×100%。

1.5.3 Western blot检测MPC-5细胞中Nephrin蛋白的表达 MPC-5细胞样品中的蛋白质用RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，转移至离心管中，12000 r·min-1，4℃离心10 min。用BCA试剂盒测量蛋白浓度。将蛋白样品与5倍上样缓冲液以4∶1的比例混合，100℃煮沸10 min使蛋白变性。每孔加入40μg的蛋白样品，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V电压电泳30 min后，溴酚蓝达到分离胶时将电压调整到120 V继续电泳。电泳结束后，在200 mA电流、4℃转膜120 min，将蛋白转移至硝酸纤维素PVDF膜。取出硝酸纤维素膜，放在5%脱脂奶粉中，37℃孵育120 min。然后用孵育一抗（Nephrin：1∶500；β-actin：1∶2000）4℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（兔抗：1∶2000；鼠抗：1∶5000）37℃孵育120 min，并用增强型化学发光试剂显影。使用软件Image J对图像进行扫描和分析确定靶蛋白与内参的比值。

1.6 统计学方法

数据使用Graph Pad Prism 8统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nesfatin-1改善高糖诱导的足细胞形态改变

显微镜下观察可见，对照组足细胞呈多边形，由胞体向外伸出足突，而25 mmol·L-1高糖条件下的高糖组可见足细胞足突出现回缩，细胞大部分呈鹅卵石状，细胞胞体较对照组变大。图中红色五角星标注为高糖诱导所致足细胞胞体变大，足突回缩。治疗组细胞胞体较高糖组变小，形态有向多边形转化的趋势，接近对照组。图中红色五角星标注为经处理后足细胞胞体变小，足突恢复，见图1。

2.2 Nesfatin-1提升高糖诱导的足细胞存活率

高糖组足细胞存活率低于对照组（P＜0.05），而Nesfatin-1处理后的治疗组足细胞存活率高于高糖组（P＜0.05），见图2。

图2 CCK-8检测各组MPC-5细胞存活率

2.3 Nesfatin-1可逆转高糖诱导的足细胞损伤

通过Western blot实验检测到足细胞标记物Nephrin蛋白表达的相对水平在高糖培养后降低。而在给予高糖后再给予Nesfatin-1处理，Nephrin蛋白表达均升高（P均＜0.05），见图3。

3 讨论

DN是糖尿病的严重并发症。糖尿病是一种常见的危险因素，可导致足细胞损伤、蛋白质及细胞器的堆积，如不及时清除可引起细胞毒性，并可诱导细胞凋亡或坏死，进而导致不可逆的足细胞损伤和功能障碍，从而减少足细胞的数量[4]。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞，是肾小球滤过屏障的关键结构，在防止血浆蛋白泄漏方面起重要作用。足细胞的损伤和丢失会导致蛋白尿，这是DN的一个标志和预测指标[5]。

Nesfatin-1是一种新发现的厌食性神经肽，由82个氨基酸组成，具有明显的厌食作用，参与饥饿和脂肪储存的调节，具有强大的代谢调节作用[6]。中枢和外周注射Nesfatin-1都能减少啮齿动物的摄食量和体质量[7]。有研究[8]报道，向第三脑室灌注Nesfatin-1可以抑制肝脏葡萄糖的产生和促进葡萄糖的摄取，这些代谢功能使Nesfatin-1成为治疗肥胖症和糖尿病的新型候选药物；Nesfatin-1的结合部位主要存在于肾脏等组织[9]；足细胞损伤和丢失时，肾小球滤过屏障的完整性将严重受损，导致蛋白尿，促进肾小球硬化，进而加速DN的进展[10-11]。2型糖尿病（T2DM）患者的血浆中Nesfatin-1水平会升高，而外周血的Nesfatin-1有助于维持葡萄糖稳态。研究显示Nesfatin-1参与了糖尿病的发生发展[6]，但Nesfatin-1是否对DN有改善作用尚不可知。因此，本研究利用细胞模型探讨Nesfatin-1是否可以改善高糖诱导的足细胞损伤。

以往的研究显示，葡萄糖的毒性与细胞的渗透压无关[3]。本研究中25 mmol·L-1高糖条件下可见足细胞形态发生了改变，由多边形有胞体向外伸出足突，变为鹅卵石状足突出现回缩且细胞胞体变大。经Nesfatin-1治疗后细胞形态有向多边形转化的趋势，胞体变小，接近对照组。结果表明高糖诱导足细胞形态的改变，而给予Nesfatin-1后，可改善高糖诱导对足细胞形态的损害。随后测定细胞存活率发现高糖诱导降低了足细胞存活率，而Nesfatin-1处理后可以改善甚至促进足细胞存活率，结果证实了高糖可诱导足细胞存活率的降低及Nesfatin-1对细胞存活率的逆转作用。高糖抑制细胞存活，经过Nesfatin-1治疗后可以减弱它的抑制作用，因此Nesfatin-1可能有双向作用，在高糖的时候改善高糖环境，低糖环境下促进糖的吸收从而改善低糖环境。

为进一步证实高糖对足细胞的损害作用和Nesfatin-1对足细胞的保护作用，本研究通过Western blot检测结果进行了进一步的佐证。Nephrin是足细胞的特异标记蛋白，具有离子通道和信号转导功能，在足细胞形态、组织结构和细胞功能调节中发挥重要作用[8]。糖尿病患者发生足细胞损伤，Nephrin蛋白的表达水平降低。本研究发现高糖诱导的小鼠足细胞Nephrin蛋白的表达水平降低，在经Nesfatin-1治疗后足细胞标志蛋白Nephrin蛋白的表达增加，证明足细胞损伤得到逆转。这些新的数据提供了Nesfatin-1可以改善高糖诱导足细胞损伤的证据。本研究中Nesfatin-1的保护作用表明，Nesfatin-1可能是开发干预DN新治疗药物有价值的先导。

综上，Nesfatin-1可以保护足细胞免受高糖诱导的损伤。然而，Nesfatin-1如何改善高糖诱导的足细胞损伤尚不清楚，Nesfatin-1对DN的改善作用也有待于进一步研究。