沉默信息调节因子1通过调节LEF-1对软骨保护作用的研究

胡学宇，杨小春，，薛 源，燕江波，周 永，金群华

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院，银川 750004）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性退行性疾病，可累及关节软骨、软骨下骨、半月板、滑膜及周围软组织[1]。其典型特征是关节软骨退变，软骨下骨骨重塑及滑膜炎性改变[2]。软骨覆盖于关节表面，起润滑和支撑作用，主要由软骨细胞和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成。软骨细胞负责ECM成分的分泌和更新，ECM反过来对软骨细胞起营养支持作用。当软骨由于磨损或机械应力造成软骨破坏，将会引起关节疼痛、肿胀及炎症反应[3]，ECM随之丢失，其合成代谢和分解代谢的平衡被打破，造成骨关节炎的发生。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT-1）作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），其对细胞生长、代谢、衰老及炎症方面有重要作用[4]。在Wnt/β-catenin信号通路中，SIRT-1可发挥软骨保护作用从而达到治疗骨关节炎的作用[5]。淋巴细胞增强因子1（lymphoidenhancer factor，LEF-1）作为T细胞因子（TCF）/LEF家族中成员[6]，主要位于细胞核中，是Wnt信号通路中重要的调节因子。LEF-1参与调控多种疾病及代谢过程的发生[7-8]。β-catenin与LEF-1蛋白相互作用可稳定细胞质中β-catenin表达水平，在Wnt信号通路作用下，β-catenin被稳定转运到细胞核内，与LEF-1结合后，调控目的基因的表达。研究显示[9]，β-catenin参与调节软骨的保护，减轻关节软骨的破坏与变性。为观察在骨关节炎发生时，SIRT-1是否参与调节LEF-1蛋白的表达来发挥软骨保护作用，进行了本研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年2—7月宁夏医科大学总医院骨三科收治的原发性骨关节炎患者行全膝关节置换手术后自愿捐赠的新鲜胫骨平台组织，共30例，其中女性18例，男性12例，排除类风湿、创伤等引起的继发性关节炎。所有实验均获得宁夏医科大学总医院伦理委员会的批准（批准文号-2020-999），并取得患者家属的知情同意且符合赫尔辛基原则。

1.2 所用材料

组织固定液（索莱宝，北京）；番红O固绿染料（索莱宝，北京）；伊红染液试剂盒（索莱宝，北京）；PV-9001二抗试剂盒（中杉金桥，北京）；磷酸盐缓冲液（中杉金桥，北京）；一抗：兔来源SIRT-1抗体（abcam，美国），兔来源β-catenin抗体（proteintech，武汉），兔来源LEF-1抗体（proteintech，武汉），兔来源CollagenⅡ抗体（abcam，美国），兔来源基质金属蛋白酶13（MMP-13）抗体（proteintech，武汉）；小量组织总RNA提取试剂盒（爱思进，美国）；一步法cDNA反转录试剂盒（全式金，北京）；qPCR试剂盒（全式金，北京）；苏木素染液（索莱宝，北京）；山羊抗兔IgG H&L（Alexa FluorR488）（abcam，美国）；抗荧光衰减封片剂（含DAPI）（碧云天，上海）。

1.3 组织处理及分组

将术中取下的新鲜标本，用骨刀、咬骨钳处理成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，按照国际骨关节炎协会（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）制定的评级评估标本，评级为0～6级，分为OA轻度组（0～2级）、OA中度组（3～4级）、OA重度组（5～6级）[10]，每组样本为30例。将新鲜标本置于多聚甲醛液中固定48 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗6 h后置于10%EDTA脱钙液中3周，每天换液1次。脱钙结束后包埋，制成蜡块标本，将蜡块切成5μm矢状位切片，置于载玻片上烤干，进行下一步实验。

1.4 苏木精-伊红（HE）和番红O固绿染色观察人膝关节胫骨平台软骨组织病理改变

首先将烤干的组织切片置于二甲苯中脱蜡，并置于梯度酒精中脱水，冲洗干净后，苏木素染色3 min，盐酸酒精分化5 s，自来水返蓝10 min，然后0.2%固绿染色3 min，1%醋酸浸洗5 s，0.1%番红染色3 min，最后二甲苯脱蜡，树胶封片。在伊红染色实验中，首先将烤干的组织切片置于二甲苯中脱蜡，在梯度酒精中脱水后用苏木素染色3 min并分化5 s，自来水返蓝10 min后用伊红染液染色2 min，最后树胶封片。在100倍光镜下观察软骨组织的病理改变和透明软骨厚度和钙化软骨厚度，采用OARSI评级标准评估软骨改变情况。

1.5 免疫组织化学检测胫骨软骨组织中SIRT-1、β-catenin、LEF-1和CollagenⅡ的表达情况

将石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，乙醇梯度脱水，于37℃下使用0.1%胰蛋白酶修复抗原15 min，3%过氧化氢液中孵育15 min，山羊血清封闭30 min，之后滴加一抗于4℃下过夜。所用一抗为Anti-SIRT-1:（abcam，1∶200），Anti-β-catenin:（proteintech，1∶200），Anti-LEF1:（proteintech，1∶200），Anti-Collagen II（abcam，1∶300）。最后选取胫骨平台软骨层区域并采用Image J 1.8.0软件分析胫骨平台组织中相应蛋白的阳性细胞面积百分比。

1.6 免疫荧光实验检测不同分组人膝关节胫骨软骨组织中LEF-1和MMP-13的表达情况

对于免疫荧光实验，将切片置于二甲苯中脱蜡，梯度脱水，抗原修复并山羊血清封闭后与相应一抗在4℃下过夜。并与Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗（Abcam，1∶300，ab150077）结合于37℃孵育60 min。使用倒置荧光显微镜观察阳性细胞，并用Image Pro-Plus 6.0软件选取软骨层区域，计数不同组别相应蛋白的阳性细胞平均吸光度（IOD）情况，使用GraphPad Prism 8.3.0统计学软件分析数据。

1.7 qPCR实验检测不同分组人胫骨软骨中SIRT-1和LEF-1的mRNA表达变化

根据2009年发布的实时定量PCR（MIQE）指南规定的信息进qPCR反应，使用组织RNA提取试剂盒（AXYGEN，Wujiang，China）提取人膝关节胫骨软骨中总RNA，使用总RNA（500 ng）制备cDNA（Bio-rad，Hercules，CA，USA），25 ng的cDNA和Syber Green的混合物（Transgen Biotech，Beijing，China）进行实时定量PCR反应。

使用的引物序列为：β-actin forward（F）为5'-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3'，Reve rse（R）为5'-ATGCCACAGGATTCCATACC-3'；SIRT-1（F）为5'-AACAGGTTGCGGGAATCCAAAGG-3'，R为5'-AGCTGGGCACCTAGGACATCG-3'；LEF-1（F）为5'-CACACAACTGGCATCCCTCATCC-3'，R为5'-GGCTCCTGCTCCTTTCTCTGTTC-3'；βactin作为参考基因。使用2-△△CT计算目的基因相对表达量。

1.8 统计学方法

实验数据应用GraphPad Prism 8.3.0统计软件进行分析，本研究数据满足方差齐性要求，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组人胫骨平台软骨组织退变程度比较

番红O固绿和HE染色结果显示：相对OA轻度组，OA重度组标本软骨大量丢失，软骨下骨暴露；而OA中度组软骨中度磨损，可见部分软骨细胞细胞核丢失，软骨细胞肥大，部分坏死，透明软骨变薄。与OA轻度组相比较，OA重度组的OARSI评分升高，OA中度组介于两者之间，见图1。三组人胫骨平台软骨组织的透明软骨厚度、钙化软骨厚度和OARSI评分差异均有统计学意义（P均＜0.01）；透明软骨厚度：OA轻度组＞中度组＞重度组（P均＜0.01）；钙化软骨厚度和OARSI评分：OA轻度组＜中度组＜重度组（P均＜0.01），见表1。

2.2 不同组胫骨软骨组织中SIRT-1、LEF-1、βcatenin和CollagenⅡ蛋白相对表达量比较

免疫组化结果显示：三组胫骨软骨组织中SIRT-1、LEF-1、β-catenin和CollagenⅡ蛋白相对表达量差异均有统计学意义（P均＜0.01），见图2、图3。；SIRT-1和CollagenⅡ蛋白表达量OA中度和重度组低于OA轻度组，OA中度组低于重度组（P均＜0.01）；LEF-1和β-catenin蛋白的表达量OA中度和重度组高于OA轻度组，OA重度组高于中度组（P均＜0.01），见表2。

2.3 不同分组中LEF-1和MMP-13蛋白表达变化的比较

免疫荧光结果显示：三组人胫骨软骨组织中LEF-1和MMP-13蛋白相对表达量差异均有统计学意义（P均＜0.01）；LEF-1和MMP-13蛋白表达量OA中度和重度组低于OA轻度组，OA中度组低于重度组（P均＜0.01），见图4、表3。

图1 人膝关节胫骨平台软骨组织病理改变

表1 不同组人胫骨平台软骨组织退变程度比较（±s）

表1 不同组人胫骨平台软骨组织退变程度比较（±s）

与OA轻度组相比*P＜0.01；与OA中度组相比#P＜0.01。

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表2 OA各组软骨各蛋白表达量比较（±s）

表2 OA各组软骨各蛋白表达量比较（±s）

与OA轻度组相比*P＜0.01；与OA中度组相比#P＜0.01。

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图2 人膝关节胫骨平台软骨组织中SIRT-1和LEF-1蛋白表达变化情况（免疫组织化学×100）

图3 人膝关节胫骨平台软骨组织中β-catenin和CollagenⅡ蛋白表达变化情况（免疫组织化学×100）

表3 OA各组中软骨各蛋白表达量分析（±s）

表3 OA各组中软骨各蛋白表达量分析（±s）

与OA轻度组相比*P＜0.01；与OA中度组相比#P＜0.01。

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2.4 不同分组中SIRT-1和LEF-1的mRNA相对表达情况

qPCR实验结果显示：三组人胫骨软骨组织中SIRT-1和LEF-1的mRNA相对表达量差异均有统计学意义（P均＜0.01）；SIRT-1和LEF-1的mRNA表达量OA中度和重度组低于OA轻度组，OA中度组低于重度组（P均＜0.01），见图5。

3 讨论

本研究结果表明，在OA发展过程中，软骨面逐渐破坏受损，软骨细胞肥大坏死，透明软骨厚度逐渐被磨损变薄，与之相反，钙化软骨厚度逐渐增加，重度组标本软骨面缺损，软骨下骨暴露，部分标本透明软骨消失，OARSI评级升高。这也验证了在临床上OA患者表现出的软骨磨损，活动时出现关节疼痛现象。本研究依据OARSI分级原则，将相应病理染色切片组织分成了OA轻度组，OA中度组和OA重度组。在不同组中测得不同蛋白的表达水平不同。

免疫组织化学实验结果显示SIRT-1蛋白的表达量随着软骨破坏程度增加其表达逐渐减少，提示其表达变化可能与OA的发生发展有关；另外，在SIRT-1表达减少的同时，LEF-1和βcatenin蛋白的表达趋势与之相反，表达量逐渐增加。这些与之前的研究结果相一致[11]，同时qPCR实验结果也证实了这一点，提示SIRT-1可能具有LEF-1的调节作用。二型胶原是软骨细胞ECM中主要的胶原，起营养、支撑、保护软骨细胞的作用[12]。在本实验中可以看到，随着软骨破坏的增加，二型胶原mRNA的表达逐渐减少，这也证实二型胶原与软骨破坏丢失有着密切联系。

图4 人膝关节胫骨平台软骨组织中β-catenin和CollagenⅡ蛋白表达情况（免疫荧光×200）

图5 不同分组人胫骨软骨组织中SIRT-1和LEF-1的mRNA相对表达情况

MMP-13作为软骨中二型胶原的主要降解酶，在OA中起重要作用[13]。在免疫荧光实验中，结果显示，LEF-1和MMP-13的蛋白表达量随着软骨破坏程度的增加而增加，提示在OA时，LEF-1和MMP-13可能存在协同作用，这也和免疫组化实验中二型胶原蛋白的表达变化相符合。结合之前研究结果推测，SIRT-1可能也具有调节MMP-13蛋白表达变化的作用。

SIRT-1表达于所有软骨和滑膜组织的细胞核中，其去乙酰化能力与多种炎症及疾病发生有关[14]。SIRT-1能调节机体的代谢功能，调节生物体胰岛素敏感性，是控制炎症的关键因子[15]。在缺乏SIRT-1基因小鼠的软骨中发现软骨细胞凋亡增加，ECM中二型胶原表达明显减少，与之相反，聚集金属基质蛋白酶13（MMP-13）表达明显增加[16]。本文免疫组织化学研究结果也进一步证明了这些观点。SIRT-1能激活人软骨细胞中的自噬，发挥软骨保护功能[17]。另外SIRT-1还参与了急性肾损伤、颅脑外伤、主动脉硬化等疾病的发病过程[18]，这些疾病中SIRT-1的表达水平降低，而在一些癌症中观察到SIRT-1表达水平显著升高[19]，提示其也许可以用于癌症治疗。伏立诺他（SAHA）作为一种天然的HDAC抑制剂被证明可以抑制IL-1β诱导的MMP-13表达[20]。同样作为天然HDAC抑制剂，曲古抑菌素（TSA）可以提高OA小鼠基质金属蛋白酶抑制物（TIMP-1）/MMP比率发挥软骨保护作用[21]。这些研究表明HDAC抑制剂在OA中也发挥着保护作用，也许是另一个不错的研究方向。