猪δ冠状病毒S1-CTD的截短表达及间接ELISA抗体方法的建立

2021-06-23瞿欢李成陈汭廖艺杰曹三杰文翼平颜其贵黄小波

生物技术通报 2021年5期

瞿欢李成陈汭廖艺杰曹三杰，2，3 文翼平颜其贵黄小波，2，3

（1.四川农业大学动物医学院猪病研究中心，成都 611130；2.农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站，成都 611130；3.四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心，成都 611130）

猪 δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）是一种新型猪肠道冠状病毒，主要引起哺乳仔猪呕吐、腹泻脱水和死亡［1］。2012年 Woo等［2］用全基因组测序首次报道了PDCoV的存在。2014年，PDCoV在美国猪群快速传播流行，成为感染普遍的腹泻病原［3-4］。至今，PDCoV已在全球多个养猪国家和地区（加拿大［5］、中国［6］、韩国［7］、泰国［8］、日本［9］等）被报道。回溯调查发现，PDCoV最早在2004年我国猪腹泻样本中就已经存在［10］。目前，我国大部分省份均存在PDCoV感染，且与其他猪肠道病原共感染的现象也较普遍［10-12］。

PDCoV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒［13］，基因组3′端主要编码病毒的结构蛋白，依次包括表面纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）［14］。Shang等［15］用冷冻电镜技术解析了S蛋白的三维结构与功能：S蛋白由非共价连接的S1、S2两部分组成，S1包含N末端结构域（NTD）和C末端结构域（CTD），两者都能够作为受体结合区域（receptor bingding domain，RBDs），而S1-CTD被认为是主要的RBD，并被证实是优势抗原表位区［16］；S2能介导宿主和病毒的膜融合。其他冠状病毒的研究表明S是最早刺激机体产生中和抗体的主要结构蛋白［17-18］。Carvajal等［19］发现感染猪流行性腹泻病毒（PEDV）的猪血清中S蛋白抗体比N蛋白抗体更持久，因此S蛋白有最佳的抗原性。

目前对于PDCoV主要包括病原学和血清学诊断。病原学诊断方法如RT-PCR、原位杂交、电镜、免疫组化等不适合大规模疫病普查。血清学诊断方法如病毒中和试验（VNT）、间接免疫荧光（IFA）操作繁琐，因此ELISA具有相对更独特的优势。Su等［20］、杨浩等［21］以原核表达的 N 蛋白建立了间接ELISA，证实该方法的敏感性和特异性高。此外，Luo等［22］用建立的重组M蛋白间接ELISA，检测了河北省的流行情况。

随着PDCoV的流行，该病对养猪业的影响将进一步加剧，疫苗的研究和应用将是控制该病的趋势，因此免疫抗体的评价具有重要的应用前景。目前基于N、M、S蛋白的ELISA抗体检测方法均有局限性，N、M相对保守但与疫苗保护相关性不大。S是诱导中和保护抗体的重要结构蛋白，产生的抗体更适合做免疫相关性评价，但全长太大，同时存在糖基化修饰而影响原核表达效果。本研究根据S基因生物信息学和前期结果［16］，截短表达了含中和抗原表位的S1-CTD区域，建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法，旨在为PDCoV的血清学调查和免疫抗体检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、表达载体及血清 PDCoV四川分离株CHN-SC2015（GenBank收录号：MK355396.1），表达载体pET28a（+），由本实验室保存。猪PDCoV阳性高免血清，猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）、猪轮状病毒（PoRV）、PEDV、TGEV等阳性血清，由本实验室提供。490份临床血清样品，采集自2012-2017年四川地区。JEV pET-28a-E、PDCoV pET-28a-N 蛋白由本实验室提供。

1.1.2 主要试剂 PrimeScript RT reagent Kit、EcoRI、HindⅢ、T4 DNA ligase购自大连宝生物工程有限公司；普通DNA产物纯化试剂盒（DP204）购自天根生化科技有限公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；HRP-兔抗猪IgG、总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 S1-CTD基因片段的扩增及表达载体的构建参照CHN-SC2015株 S基因序列，针对含抗原表位区域S1-CTD（S基因的832-1 848 bp）设计引物（5′- CGGAATTCATGGATGGGTTCTACTCCGAC-3′/5′-CCAAGCTTTGAGGTGTATTGTGCCAGT -3′）。进行 PCR 扩增，反应条件为98℃ 5 min；98℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 40 s，共 34个循环；72℃ 5 min。PCR产物经纯化后与 pET28a载体进行双酶切（EcoRⅠ和Hind Ⅲ），构建原核表达质粒 pET28a-S1CTD，经PCR、双酶切和测序鉴定（图1）。

图1 pET28a-S1-CTD构建流程图Fig.1 Construction process of pET28a-S1-CTD

1.2.2 S1-CTD重组蛋白的表达、纯化及鉴定质粒pET28a-S1-CTD和空载分别转化至BL21（DE3）中，IPTG 37℃诱导12 h，SDS-PAGE分析表达情况。包涵体溶解后，Ni+柱纯化蛋白，按照包涵体蛋白液与透析缓冲液体积1∶50比例依次用含不同尿素浓度的复性缓冲液透析复性6 h；以1∶250稀释的猪抗PDCoV阳性血清为一抗，以1∶5 000倍稀释的兔抗猪IgG-HRP为二抗进行Western blot鉴定。

1.2.3 间接ELISA最佳条件的筛选用方阵滴定法确定反应最佳条件。S1-CTD蛋白倍比稀释为 16-0.5 μg/100 μL；抗PDCoV 猪阳性和阴性血清倍比稀释至 1∶50-1∶800；抗原包被条件分别在 4℃过夜，37℃ 2 h，37℃ 1 h；采用 1% BSA、2% BSA、1%脱脂牛奶、5%脱脂牛奶作为封闭液；待检血清37℃孵育0.5、1、1.5和2 h；兔抗猪 IgG-HRP作1∶2 500-1∶10 000稀释，作用0.5、1、1.5 h；37℃显色5、15、30 min。阳性与阴性OD450nm比值（P/N）最大时，确定该方法的最佳反应条件。

1.2.4 间接ELISA临界值的确定检测40份PDCoV阴性血清，计算样品OD450nm值的平均数（）和标准方差（S D），当OD450nm≥+3SD判定为阳性，当OD450nm≤+2SD时，可判定为阴性。介于二者之间为可疑需重测。

1.2.5 特异性试验用间接ELISA检测CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、JEV、PoRV、PEDV、TGEV等阳性血清，同时设立PDCoV阴阳性血清对照，评估该方法的特异性。

1.2.6 重复性试验批内重复试验：随机取7份未知临床血清样品，使用同批次的酶标板，检测5次。批间重复性试验：用5个不同批次蛋白包被的酶标板，同时检测7份不同的血清样品。计算批内和批间变异系数，以检测其重复性。

1.2.7 符合率的测定随机选取PDCoV阴阳性血清样本30份，分别用间接ELISA和VNT［23］检测，VNT试验中血清抗体效价≥1∶4时判定为阳性，否则为阴性，计算两种方法的符合率。

1.2.8 间接ELISA的初步应用取2012-2017年从四川收集的490份猪血清样本，用ELISA进行PDCoV感染的血清学调查，了解该病在四川猪群的流行情况。

2 结果

2.1 S1-CTD基因原核表达载体的鉴定

重组表达载体pET28a-S1-CTD经RT-PCR和双酶切鉴定，结果显示均得到大小约1 000 bp的条带，与预期相符（图2）。测序结果也证实pET28a-S1-CTD构建成功。

2.2 S1-CTD重组蛋白的表达、纯化及鉴定

取含质粒pET28a-S1-CTD的表达菌经IPTG诱导表达，SDS-PAGE显示重组蛋白大小约41 kD，空载表达菌诱导无目的蛋白表达，说明重组蛋白S1-CTD表达成功（图3-A）。电泳显示目的蛋白主要以包涵体存在，收集包涵体洗涤两次并溶解，经亲和层析纯化，得到约41 kD的目的蛋白（图3-B）。Western blot显示重组蛋白与猪抗PDCoV阳性血清发生特异性反应（图3-C）。

图2 重组质粒pET28a-S1CTD的PCR（A）及双酶切鉴定（B）Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a-S1CTD by PCR (A) and double digestion (B)

2.3 间接ELISA最佳反应条件的筛选

基于S1-CTD蛋白为抗原的间接ELISA，经方阵滴定确定了最佳条件如下：1 μg/100 μL 的S1-CTD蛋白37℃包被2 h，用2%BSA在37℃封闭1.5 h；血清最佳稀释度为1∶50，在37℃反应1 h；兔抗猪IgG-HRP抗体以1∶5 000稀释在37℃下作用0.5 h，TMB在37℃显色15 min。

2.4 间接ELISA临界值的确定

2.5 特异性试验

用建立好的ELISA检测CSFV、PRRSV、PCV、PRV、JEV、PoRV、PEDV、TGEV的阳性血清，设PDCoV阴性和阳性血清为对照。结果显示PDCoV阳性血清OD450nm值为0.932，而检测PDCoV的阴性血清与8种常见猪病毒的阳性血清OD450nm值均小于0.377，表明该方法与其他病毒阳性血清无交叉反应，特异性好（图5）。

图3 重组蛋白S1-CTD的SDS-PAGE与Western blot分析Fig.3 The SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant S1-CTD protein

图4 临界值的测定Fig.4 Determination of the cut-off value

图5 间接ELISA的特异性试验Fig.5 Specificity of the indirect ELISA

2.6 重复性试验

ELISA重复性试验结果显示，批内变异系数在2.65%-9.57%，批间变异系数在6.01%-9.98%，两者均小于10%，表明该方法重复性较好（表1）。

表1 间接ELISA的重复性试验Table 1 Repeatability of the indirect ELISA

2.7 符合率试验

用间接ELISA和VNT试验检测随机选取的30份血清样品，结果表明，间接ELISA检测的阳性率为 40%（12/30），阴性率为 60%（18/30）；VNT试验的阳性率为36.7%（11/30），阴性率为63.3%（19/30）；两者间阳性符合率为81.8%（9/11），阴性符合率为84.2%（16/19），总符合率为83.3%（25/30）（表2）。

表2 间接ELISA与VNT对血清样品的比较性检测Table 2 Comparative detection of serum samples by indirect ELISA and VNT

2.8 ELISA的初步应用结果

用间接ELISA检测2012-2017年收集的四川地区490份猪血清样品，结果显示PDCoV总阳性率为（241/490）49.18%，其中在达州、宜宾、阿坝、巴中部分猪场的阳性率高达93.33%-100%，可见PDCoV在这些地区呈地方性流行（表3）。

3 讨论

猪δ冠状病毒是一种新的猪肠道冠状病毒，该病的诊断方法尚不成熟，因此建立一种简单、特异、灵敏的抗体检测方法对该病的诊断和监测具有十分重要的意义［24］。本研究在前期曾尝试表达完整S蛋白，但表达效果不理想，经过S基因生物信息学分析及参考PEDV S蛋白表达策略后［25］，将S基因进行截短表达，分别构建了pET28a-S1-NTD（50aa-286aa）、pET28a-S1-CTD（278aa-616aa）以及pET28a-S2（601aa-1087aa）原核表达载体，在对比了3种原核表达蛋白的量、纯化难易程度和反应原性后发现S1-CTD蛋白是后续研究的最佳选择［16］。经大量诱导表达与超声破碎后，目的蛋白主要以包涵体存在。在前期本研究利用切胶纯化包涵体蛋白，但一次性制备较多PAGE胶并不能满足后续复性实验所需蛋白量，因此选择Ni+亲和层析柱纯化溶解后的包涵体蛋白。

表3 PDCoV临床样品检测结果Table 3 Clinical detection of PDCoV samples

目前检测PDCoV抗体的间接ELISA方法主要以N蛋白较多，但有研究表明PEDV的M和N蛋白与PDCoV会发生交叉反应［26-27］，而S蛋白是介导保护性免疫应答的主要蛋白，因此以S蛋白为抗原建立抗体方法在免疫评价中将具有较好的应用前景［28-30］。王经纬等［31］用昆虫杆状病毒表达系统表达S1蛋白作为包被抗原建立的ELISA检测方法灵敏度更高，但真核表达存在成本高、周期长等缺点。而本研究基于PDCoV的S1-CTD采用的是原核表达系统，抗原制备更简单。本研究表达的蛋白都以包涵体的形式存在，不同批次复性后的重组蛋白在稳定性和活性上均略有差异［32-33］。因此ELISA试剂盒的组装和推广应用，仍需要在蛋白表达、包被和试剂配比等工艺上优化。

PDCoV尚无商品化的抗体ELISA试剂盒，为了评价本研究建立的ELISA方法，我们选择了VNT作为对照进行比较。选取的30份猪血清样本，ELISA与VNT两种方法的总符合率达到83.3%。其符合率不够高可能是因为VNT测定的是与血清中和后病毒的感染力，从而判定抗体的中和能力，而ELISA只能判定血清的阴阳性，数值不能直接反映抗体水平，当血清中抗体效价太低时，VNT判定为阴性，但仍然在ELISA的检测范围之内，为阳性，因此本试验ELISA检出的阳性率比VNT的偏高。血清学调查显示PDCoV在我国感染非常普遍，逢凤娇等［34］用ELISA检测我国2014-2016年不同地区猪场的100份临床血清，PDCoV阳性率高达45.9%；Su等［20］检测黑龙江的319份样本，PDCoV抗体阳性率达11.59%；杨浩等［21］以 N蛋白建立的 ELISA 检测湖北、河南、河北地区的部分猪场267 份临床血清，PDCoV 抗体阳性率高达 66.67%。本研究以S1-CTD蛋白建立的ELISA检测2012-2017年收集自四川地区的490份猪血清，PDCoV总体阳性率为49.18%，从血清学角度证实PDCoV已在四川地区流行，但不同地区感染率有较大差异。结果显示在达州、宜宾、阿坝、巴中部分猪场的血清阳性率高达93.33%-100%，我们追踪样品记录发现血清样品集中来源于部分猪场，且部分猪场存在腹泻发病史，因此这些地区的样品阳性率仅代表采样猪场的信息，不能代表该地区的总体感染情况。四川总体的感染情况尚不完全清楚，若全面开展PDCoV感染的血清学调查，则要从血清样品收集时间（季节）、猪群结构、免疫背景、样品猪场的发病信息、样品区域覆盖、采样的猪场数量、猪场抽样比例等综合设计，才能相对准确反映该病感染的真实情况。本次检测初步反映PDCoV在四川局部地区感染普遍，应引起我们的高度重视。